LED光质对2种石斛兰组培苗增殖、生根及生长的影响

为提高石斛兰的组培效率,以‘甜心’石斛和‘红粉天宫’兜唇石斛为研究对象,研究白光(W,可见全光谱400~700 nm)、红蓝绿组合光(R3B6G0、R3B6G1、R3B6G3、R6B3G0、R6B3G1、R6B3G3、R3B3G3)共8种LED光质对石斛兰增殖与生根的影响,并系统比较增殖过程中2种石斛兰增殖系数、鲜重、干重和干物质含量的差异,以及生根过程中根数、平均根长、茎粗、新芽数、株高、叶数的差异。结果表明‘,甜心’石斛在R6B3G1的光质下增殖效果最好,培养45 d增殖系数达到2.55个/株,鲜重、干重和干物质含量分别为0.54 g/株、0.053 g/株和9.8%。其次为R6B3G0处理,而对照W和R3B6G3效果较差。生根方面,‘甜心’石斛则在R6B3G3组合光质处理下效果最佳,根数和平均根长分别为11.36根/株和2.64 cm,其次为R6B3G1,而对照W和R3B3G3效果最差。‘红粉天宫’兜唇石斛在R6B3G3光质组合增殖效果最好,增殖系数达到1.19个/株,鲜重、干重和干物质含量分别为0.718 g/株、0.0548 g/株和7.91%,其次为对照W,而R6B3G0效果较差。生根方面,‘红粉天宫’兜唇石斛在R6B3G1组合光质处理下效果最好,其次为R6B3G3,而R3B6G3和对照W效果较差。可见,在R6B3红蓝光质下适当补充一定绿光,有利于2种石斛兰增殖和生根壮苗。

兜唇石斛化学成分的研究

目的研究兜唇石斛Dendrobium aphyllum(Roxb.)C.E.C.Fisch.的化学成分。方法兜唇石斛水提取物采用硅胶、ODS、MCI、Sephadex LH-20、制备TLC、制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到17个化合物,分别鉴定为芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(1)、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(2)、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷(3)、咖啡因(4)、大黄酚(5)、大黄素甲醚(6)、大黄素(7)、胸腺嘧啶脱氧核苷(8)、2-苯乙醇-β-D-葡萄糖苷(9)、对羟基苯甲酸(10)、原儿茶酸(11)、对羟基桂皮酸(12)、香草酸(13)、对羟基苯甲醛(14)、丁香醛(15)、松柏醛(16)、间苯三酚三甲醚(17)。结论化合物1~2、4、9为首次从石斛属中分离得到。

发酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr和Asp-Tyr-Asp-Asp的稳定性研究

以DPPH和ABTS自由基清除率为考查指标,探究不同储存时间、pH值、金属离子、储存温度及人工模拟消化系统对兜唇石斛发酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr(DDDY)和Asp-Tyr-Asp-Asp(DYDD)抗氧化活性的影响,并进一步研究2种发酵多肽的稳定性。结果表明:随着储存时间的延长,DDDY和DYDD的DPPH和ABTS清除率均明显下降,DPPH清除率在储存16 h后分别下降了约73.43%和73.22%;DDDY和DYDD在酸性或弱酸性环境下的稳定性较好,当pH值为2.0~12.0时,其ABTS清除率分别下降了约66.00%和70.81%,而对DPPH清除率的影响不大;金属离子会明显提高2种发酵多肽的ABTS清除率,其中受Na^(+)、K^(+)和Fe^(3+)这3种金属离子影响较大;过高和过低的储存温度均会降低2种发酵多肽的DPPH和ABTS清除率,其中DYDD的ABTS清除率受储存温度影响较大;DDDY和DYDD的抗氧化活性在人工模拟消化系统中随着消化作用时间的延长均明显降低。2种发酵多肽的稳定性受环境影响较大,未来可通过包埋或基团连接等方式深入研究提高其稳定性的路径。

兜唇石斛发酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr和Asp-Tyr-Asp-Asp对LPS诱导RAW264.7细胞的抗炎作用

为了研究兜唇石斛发酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr(DDDY)、Asp-Tyr-Asp-Asp(DYDD)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞抗炎活性。以合成的兜唇石斛发酵多肽为研究对象,采用噻唑蓝法筛选增殖活性最高的发酵多肽浓度,通过中性红吞噬实验和倒置显微镜观察发酵多肽对细胞的吞噬作用和分化形态变化,使用ELISA试剂盒测定细胞中NO及细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量。结果表明:12.5、25、50和100μg/mL四组质量浓度的发酵多肽对细胞无毒性并有增殖作用;100μg/mL的DDDY和DYDD和1μg/mL的LPS处理可以激活细胞,增强细胞吞噬能力,相对吞噬率为2.05%、1.97%和2.19%;构建LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型,发现两种发酵多肽处理有效抑制细胞分化,使细胞恢复正常形态;抑制细胞NO分泌能力,100μg/mL DDDY和DYDD处理组的NO分泌能力降低到LPS组的0.41倍和0.49倍;并且对抑炎细胞因子分泌能力的提高和促炎细胞因子的降低有显著效果,均表现出剂量反应关系。由此可知,DDDY和DYDD对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应具有抗炎作用,为后面探究发酵多肽的炎症机制提供理论支持。

兜唇石斛发酵多肽抗氧化活性与氨基酸结构的关系

前期采用微生物固态发酵法获得兜唇石斛多肽DPP,通过液相质谱发现DDDY、DYDD、MAK、AVTF、RSS、MLCA六条多肽序列。为进一步研究DPP抗氧化功能与其氨基酸结构的关系,该研究借助QSAR模型,采用体外抗氧化实验、人肝癌细胞(HepG2)的CAA试验和红细胞溶血试验评价多肽的抗氧化能力,通过相关性分析研究氨基酸结构对抗氧化肽活性的影响。结果表明:六条合成多肽及母肽均具有抗氧化活性(P<0.05)。其中MLCA表现出最强的DPPH、ABTS^(+)自由基清除能力、铁还原力和红细胞溶血保护能力,IC50分别为0.89、0.99、1.34、0.68 mg/mL;AVTF的细胞抗氧化活性最强,EC50为0.02 mg/mL。供氢供电子氨基酸以及疏水性氨基酸有助于DPP的抗氧化活性。N端氨基酸为Met,N端第二位为Leu、Val或C端第三位为Leu是各位点的有利氨基酸残基。另外,还发现Ala可以促进多肽的抗氧化作用,Tyr位置的改变对多肽的抗氧化能力的影响较小。该研究为深入探究抗氧化肽的构效关系提供了理论依据,为抗氧化肽的进一步研究奠定基础。

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNAITS序列,设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC JB01S和DC JB01X,并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别.在进行位点特异性PCR鉴别之前,首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增,以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度.当退火温度上升为64℃,只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来,而其它的37种石斛属植物均为阴性.该鉴别反应重复性好,已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用.与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点.

兜唇石斛的化学成分研究

目的:研究兰科石斛属植物兜唇石斛Dendrobium aphyllum全草的化学成分。方法:应用多种柱色谱及重结晶方法进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。结果:分离并鉴定了8个化合物,其中黄酮类化合物3个,分别为4′-甲氧基苜蓿素(1),苜蓿素(2),7,3′,5′-tri-O-methyltricetin(3);酚类化合物丁香酸(4);木脂素类化合物丁香脂素(5);其余化合物为阿洛醇(6),蔗糖(7)和icariside D_2(8)。结论:化合物1～3,6～8为首次从该属植物中分离得到,其他化合物均为首次从该植物中分离得到。

兜唇石斛酚类化学成分研究

目的:对兰科石斛属植物兜唇石斛Dendrobium aphyllum的酚类化学成分进行研究。方法:采用硅胶、凝胶及反相柱色谱和重结晶等技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据并参考文献鉴定化合物结构。结果:分离并鉴定了11个芳香族类成分,其中9个为类化合物:4,4′-二羟基-3,3′,5-二甲氧基联苄(1),3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄(2),3,3′-二羟基-5-甲氧基联苄(3),3,4,5-三羟基-3-甲氧基联苄(4),3,5,4′-三羟基联苄(5),3,5-二甲氧基-4,4′-二羟基-联苄(6),2,5-二羟基-4-甲氧基菲(7),2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲(8)和2,5-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(hircinol,9)和2个苯乙烷类衍生物:对羟基苯乙醇葡萄糖苷(10)和对羟基苯乙酸(11)。结论:以上化合物均为首次从该种植物中分离得到,化合物10,11为首次从石斛属分离得到。

兜唇石斛HPLC特征图谱研究

目的建立兜唇石斛HPLC特征图谱。方法采用Zorbax SB C18色谱柱;流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(梯度洗脱);检测波长为270 nm;柱温为35℃;流速为1.0 mL·min-1。结果兜唇石斛标示出42个共有峰;10批样品的相似度为0.901～0.961;兜唇石斛鲜品与兜唇石斛干品(水草枫斗)特征峰基本一致。结论此方法准确可靠,重复性好,为兜唇石斛的质量控制提供了方法依据。

兜唇石斛的组织培养研究

以兜唇石斛的成熟蒴果作为外植体,比较不同的培养基、激素等因素对种子发芽及试管苗生根的影响。结果表明:以成熟蒴果为外植体能够诱导成苗,种子萌芽的最适培养基为:MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+GA 1.0mg/L+香蕉汁150g/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+活性炭2g/L,适宜的生根培养基为:1/4MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+香蕉汁150g/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+活性炭2g/L。

基于Caco-2单层细胞模型的兜唇石斛多糖的转运机制研究

以兜唇石斛多糖(DAP)为研究对象,借助人小肠上皮细胞Caco-2(the human colon carcinoma cell line)单层细胞模型,体外模拟DAP在小肠中的转运情况。在前期得到的DAP为基础,探究DAP的粘度对其转运情况的影响,同时建立Caco-2细胞的模型,采用MTT法测定DAP对Caco-2细胞存活率的影响,并考察了DAP在小肠的吸收转运的特征。实验表明:DAP的粘度与其在Caco-2细胞中的转运能力呈负相关趋势,粘度越大,转运速率越慢;在测定TEER值及荧光素钠渗透情况,观察Caco-2细胞的形态,建立了良好的细胞模型;DAP的存在下,Caco-2细胞的存活率为91.8%以上,因此DAP对Caco-2细胞存活无影响;DAP在Caco-2不同单边层的转移率分别为0.35%±0.02%和0.32%±0.02%,表观渗透率分别为(0.42±0.02)×10^-6 cm/s和(0.19±0.18)×10^-6 cm/s,表明DAP在小肠中不易被吸收。本研究所得结果为进一步研究DAP在肠道中的吸收机制奠定基础。

云南德宏兜唇石斛种植情况调查

调查报告显示,历经10年的发展,德宏州兜唇石斛人工栽培面积达199 hm2,投产197.7 hm2,鲜条年产量1 666.1 t,年产值达8330.5万元,平均产值42.15万元/hm2;有72家石斛种植加工企业,44家石斛协会和专业发展合作社,辐射带动821户种植发展兜唇石斛,吸收了1 000余人的富余劳动力就业;种植均为集约化种植模式;产品主要为石斛鲜品,经连续2年质量安全监测,鲜品农药和重金属残留都达到国家安全标准。报告还针对产业发展中存在的野生资源保护,种质混杂,规模化、标准化,集资渠道,产品附加值低的问题提出建议。

兜唇石斛植物学特征和生长习性研究

通过试验观察,对兜唇石斛的植物学特征进行了描述;对其生物学习性的观察看到,花期在3月中下旬至4月下旬,开花同时抽新芽、长新根4~8条;5-7月是伸长生长期,8-10月是茎增粗期,10-11月植株成熟,12月至翌年1月植株休眠;茎寿命4年,4年以后,茎黄化萎缩,失去药用价值;果期为5-12月,10-12月种子成熟;单花寿命9~11 d,开花后2~5 d内进行人工授粉可以获得较多的种质资源。

兜唇石斛种子无菌播种与快速繁殖

以兜唇石斛八成熟蒴果为外植体,通过对其种子无菌萌发培养、无机盐浓度筛选、活性炭浓度筛选、有机物种类及浓度筛选、丛生芽继代增殖及生长素种类及浓度筛选,确定适合兜唇石斛增殖和生根壮苗的培养基,建立兜唇石斛组培快繁技术体系。结果表明,兜唇石斛种子萌发培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA+土豆粉30 g/L+活性炭0.2 mg/L,80 d左右获得实生小苗;不同基础培养基对兜唇石斛的增殖系数、生根数、根长及株高均显著影响,最适基础培养基为3/4 MS;添加活性炭显著影响兜唇石斛小苗的生长,最适活性炭浓度为0.1 g/L,当浓度大于0.2 g/L时,开始抑制兜唇石斛小苗生长;香蕉粉及土豆粉能明显促进兜唇石斛生长,增殖可添加30 g/L香蕉粉,30 g/L土豆粉,生根壮苗可添加40 g/L香蕉粉;KT对兜唇石斛丛生芽增殖无显著影响,0.5 mg/L的6-BA增殖系数最大(4.84);NAA及IBA对兜唇石斛的生根壮苗效果影响显著,最适浓度为NAA 1.0 mg/L,IBA 0.5 mg/L,培养45 d增殖系数为5.92,平均每株生根数为27.0,平均根长1.88 cm,株高1.92 cm。通过生产实践最终确认生根壮苗培养基为3/4 MS+蔗糖25 g/L+卡拉胶8 g/L+香蕉粉40 g/L+活性炭0.1g/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L;炼苗移栽30 d成活率100%,60 d成活率85%。该文初步建立了兜唇石斛种子无菌播种与快速繁殖技术体系,为兜唇石斛的快速繁殖和种质资源保存提供理论和技术支持。

兜唇石斛扦插繁殖试验

用兜唇石斛一年生鲜茎为插穗的扦插试验结果表明:4-7月是抽芽期,其中5月抽芽最多,占总抽芽数的69.64%,6-10月是出圃期,7月出圃的扦插苗最多,达总出圃数的53.93%;2月份扦插的插穗生长最好,插穗健壮、整齐,出圃时间集中,出圃率达91.44%;底部茎节是最好的扦插材料,可以获得优质扦插苗,扦插成本较低;参试的植物激素和扦插基质对插条抽芽生根无明显影响。

云南不同种兜唇石斛评价

为了解人工栽培不同种兜唇石斛的品质,掌握不同表现型兜唇石斛茎的特点,对人工栽培不同种兜唇石斛进行了评价。结果表明,兜唇石斛种质来源主要有云南本地种、缅甸种、印度种和老挝种;表现型有大水草、小水草、细水草和红水草。鲜品口感评价以云南本地种大水草口感最好,清醇,稍苦,回甜;其它种口感差别不大。枫斗口感评价,缅甸种大水草和云南本地种红水草为优-,云南本地种小水草、缅甸种小水草、印度种小水草良+,老挝种细水草和老挝种小水草良。云南本地和缅甸种大水草资源量较少,多糖含量高,枫斗品相好,适宜大面积推广;云南本地、缅甸种和印度小水草资源量较多,表现稳定,产量高,枫斗品相好,是目前云南主要种植的种;老挝种大水草、细水草品质稍差,产量不高,枫斗品相差,种植的面积不多;云南本地种红水草产量低,不宜做大面积推广种植。

NaCl胁迫下γ-氨基丁酸对兜唇石斛组培苗生长的影响

以兜唇石斛[Dendrobium aphyllum(Rohb.)C.E.Fishcher]试管苗为材料,探讨在不同浓度NaCl胁迫下,不同浓度外源GABA对兜唇石斛组培苗生长的影响,通过测定兜唇石斛组培苗叶片中的脯氨酸含量来确定外源GABA对盐胁迫的缓解效应。结果表明,在相同浓度的NaCl胁迫下,加入GABA可明显提高兜唇石斛组培苗中的脯氨酸含量,说明外源GABA对兜唇石斛组培苗盐胁迫有明显的缓解效应,且缓解效果最佳的外源GABA浓度为7 mmol/L。

组培过程中兜唇石斛的耐盐性研究

以兜唇石斛试管苗为材料,研究组织培养过程中试管苗的生长状况,通过测定组织培养过程中分化苗合成的脯氨酸含量来确定兜唇石斛的耐盐性。最终得到最适合兜唇石斛试管苗生长的培养基是MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA;进行耐盐培养时得到脯氨酸含量最高的培养基是MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%Na Cl。

兜唇石斛多糖的研究

从兜唇石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍａｐｈｙｌｌｕｍ）的茎中提取到３种多糖：ＡＰ－１，Ａｐ一２，Ａｐ一３，玻璃纤维纸电泳、超速离心和凝胶层析证明：三者都为单一均匀成分。３种多糖的特性粘数（［ｎ］）分别为４２６．９６，４１６．９６，２３４．０３；分子量（Ｍｗ）分别为８６３００，６１５００，４３１００；旋光度（）分别为－３０．０００，－３３．０００，１７．０００。经化学方法和光谱分析证明：ＡＰ为Ｂ（１→４）连接的、含Ｏ一乙酰基的、吡喃型的直链Ｄ一葡萄甘露聚糖。动物体内试验表明：ＡＰ有免疫增强作用。

天宫石斛快繁技术研究

以天宫石斛荚果为外植体,探究天宫石斛种胚快繁技术。选择荚果外植体适合消毒时间,添加不同有机添加物诱导原球茎,调节生长调节剂种类及浓度配比,诱导增殖分化,添加适当浓度生根壮苗活性炭。结果表明,消毒10 min效果最佳,污染率为30%;添加土豆30 g/L培养基原球茎诱导效果最佳,诱导率为95%;6-BA 1.5 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基增殖效果最佳,增殖系数为9.4;活性炭1.2 g/L生根壮苗效果最好,平均生根数达8.54。