叠鞘石斛组织培养及植株再生体系优化

以叠鞘石斛成熟种子为材料,使用IBA、6-BA和NAA共3种生长调节剂与香蕉泥和椰子汁有机物等组合,采用3因素3水平正交设计及单因素设计进行组织培养研究.结果显示,最佳叠鞘石斛原球茎培养基为MS+50 g/L椰子汁+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,40 d增殖系数为6.75,分化率为84.38%;最佳叠鞘石斛壮苗生根培养基为1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂.通过该技术,可以在较短时间获得大批量优质叠鞘石斛种苗,为大规模叠鞘石斛药材生产提供基础.

叠鞘石斛花的化学成分研究

利用硅胶和Sephadex LH-20凝胶柱色谱对叠鞘石斛花瓣的石油醚和氯仿部位进行分离纯化,采用现代波谱技术对相关化合物进行结构鉴定,研究叠鞘石斛(Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.Denneanum)花的化学成分。从叠鞘石斛花95%的乙醇提取物中分离出5种化合物,分别鉴定为正三十烷酸、邻羟基苯丙酸、β-谷甾醇、二十八烷酸和正二十六碳-5,8,11-三烯酸。结论这些化合物是首次从该植物花中分离得到的。

叠鞘石斛化学成分研究

目的研究叠鞘石斛化学成分。方法叠鞘石斛乙酸乙酯部位采用硅胶柱层析、重结晶等方法分离纯化,并通过理化性质和波谱技术鉴定化合物结构。结果从叠鞘石斛中分离得到10个化合物,分别鉴定为松柏醛(1)、香兰素(2)、香草酸(3)、丁香醛(4)、丁香酸(5)、5-乙酰氧甲基糠醛(6)、5-羟甲基糠醛(7)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(8)、草木樨苷甲酯(9)、4,5-二羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲(10)。结论所有化合物均为首次从叠鞘石斛中分离得到。

叠鞘石斛与石斛药典收载品种脂溶性成分GC-MS对比研究

目的运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法研究叠鞘石斛与石斛药典收载品种的脂溶性成分,为叠鞘石斛的开发利用提供参考。方法采用有机溶剂法提取脂溶性成分,运用GC-MS进行分离测定,结合质谱库检索技术对化合物进行结构鉴定,应用色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。结果初步鉴定出95种化合物,其中分别从叠鞘石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛中分析鉴定出33、55、37、36种化合物,四者脂溶性成分在组成和相对含量上均有一定差异。结论首次采用GC-MS联用技术对叠鞘石斛与药典收载品种金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛进行对比研究,为叠鞘石斛的进一步开发利用提供了一定的理论基础。

川产道地药材叠鞘石斛茎叶花脂溶性成分气相色谱-质谱联用分析

目的研究叠鞘石斛茎、叶和花脂溶性成分,为叠鞘石斛的综合开发利用提供科学依据。方法运用GC-MS法对叠鞘石斛不同药用部位脂溶性成分进行分离测定,结合质谱库检索系统对化合物进行结构鉴定,应用色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。结果叠鞘石斛茎中鉴定出33个化学成分,占总含量的75.84%;叶中鉴定出41种化学成分,占总含量的61.56%;花中鉴定出53种化学成分,占总含量的81.90%。结论首次对川产道地药材叠鞘石斛不同部位脂溶性成分进行定性定量研究,共鉴定出93种成分。不同药用部位脂溶性成分有较大差异,主要成分均为脂肪酸类、酯和烃类。

川产叠鞘石斛与石斛药典收载品种指纹图谱对比研究

目的:对叠鞘石斛与石斛药典收载品种金钗、鼓槌和流苏石斛HPLC-DAD-ELSD指纹图谱进行对比研究。方法:采用Dikma C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;乙腈-0.5%冰醋酸水溶液梯度洗脱;柱温:30℃;流速:1 mL/min;DAD串联蒸发光散射检测器检测。结果:首次建立了石斛的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱鉴别方法,并对9个指纹峰进行了标定。首次对叠鞘石斛和石斛药典收载品种金钗、鼓槌、流苏石斛指纹图谱进行对比研究。结论:建立的方法稳定、可靠、重现性好,可直接了解石斛品种与化学成分变化的关系。叠鞘石斛与石斛药典收载品种有一定相似性,但相似度较低。

川产叠鞘石斛挥发油化学成分的GC-MS分析

目的:采用GC-MS联用法对叠鞘石斛挥发油化学成分进行研究,为叠鞘石斛的综合利用提供参考。方法:采用有机溶剂-水蒸气蒸馏法提取挥发油,并运用GC-MS进行分离测定,结合质谱库检索技术对化合物进行结构鉴定,应用色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。结果:叠鞘石斛挥发油中分离出115种成分,鉴定出70种化学成分。结论:首次对叠鞘石斛挥发油化学成分进行定性定量研究,主要为烷烃类、醛类和醇类。

GC-MS/MS测定叠鞘石斛中乐果等三种农药残留的一测多评研究

以叠鞘石斛(Dendrobium aurantiacum)为研究对象,样品采用乙腈提取,经Cleanert TPH专用净化柱净化。用GC-MS/MS测定样品,根据色谱相对保留时间和质荷比信息对样品进行定性分析,以乐果二级离子扫描峰(125.0/79.0)面积为参照峰,建立以乐果为对照品,测定叠鞘石斛中乐果等三种农药残留量的GC-MS/MS方法。结果表明,乐果、敌敌畏、毒死蜱进样量在0.1~1.0 ng与它们的色谱峰面积有较好的线性关系,最低检出限(以进样量计)分别为1.399×10^(-2)、2.279×10^(-4)、1.757×10^(-4) ng;平均回收率分别为95.4%、95.0%、94.7%。该一测多评方法简单快速,定量准确,适用于叠鞘石斛中乐果、敌敌畏、毒死蜱农药残留的同时测定。

基于灰色关联度的叠鞘石斛叶抗氧化部位的筛选

以不同浓度乙醇对叠鞘石斛[Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.denneanum(Kerr.)Z.H.Tsi.]叶进行提取,再用不同极性溶剂对抗氧化活性较高的60%乙醇粗提取物进行萃取,分别得到石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层,采用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)和紫外-分光光度法对各部位进行成分分析,以DPPH自由基清除活性为指标,利用灰色关联度进行相关性分析,筛选主要的抗氧化活性部位。其中,总黄酮在正丁醇层最高(24.89%);多糖在水层最高(0.23%);各萃取层均有抗氧化活性,DPPH自由基清除能力强弱顺序为水层>正丁醇层>乙酸乙酯层>二氯甲烷层>石油醚层。筛选出正丁醇层、水层为抗氧化主要活性部位,其抗氧化活性是黄酮类、多糖等成分协同作用的结果,为进一步提取抗氧化活性化合物,开发天然抗氧化剂提供一定的指导。

叠鞘石斛HPLC特征图谱的研究

目的建立叠鞘石斛HPLC特征指纹图谱。方法采用色谱柱ZORBAX SB-Aq;以乙腈-0.2%（体积分数）H3PO4为流动相,梯度洗脱,柱温为25℃;流速为1.0 m L/min;检测波长为270 nm。结果 10批叠鞘石斛共标识出12个共有峰,确定11号峰为石斛酚;10批样品的相似度为0.846~0.986。结论本方法准确可靠、稳定性好,可为叠鞘石斛的质量控制提供有效依据。

GUM法和MCM法评定叠鞘石斛多糖含量测定方法的不确定度

目的:利用GUM法和MCM法对叠鞘石斛多糖含量测定方法进行不确定度评定。方法:建立数学模型,采用GUM法和MCM法对本测定方法的不确定度进行评定并将结果进行比较。结果:MCM法所得95%包含区间为[15.28%,16.16%],GUM法与MCM法差异较大且GUM法未通过检验。结论:MCM法所得结果作为不确定度评定结果,叠鞘石斛多糖含量测定方法准确可靠。

叠鞘石斛叶黄酮类成分的“点-线-面”质量分析

目的建立超高效液相色谱(UPLC)-二极管阵列检测器(PDA)法对叠鞘石斛叶进行“点-线-面”质量分析评价。方法采用UPLC-PDA法,色谱柱为ACQUITY UPLC-PDAHSS T3 C18(2.1 mm×100 mm,1.8μm);以四氢呋喃-乙腈-甲醇(10:22:5)-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱;体积流量0.3 mL·min-1;检测波长337 nm;柱温30℃;在此色谱条件下,同时测定芹菜素-6,8-二-C-葡萄苷、异夏佛塔苷、芦丁3个成分含量——“点”,并测定总黄酮的含量——“线”,对10批叠鞘石斛叶指纹图谱进行全成分分析及相似度评价——“面”。结果3种单一成分及总黄酮成分线性关系良好,平均加样回收率及相应RSD分别为99.15%(2.48%)、101.43%(1.86%)、96.42%(2.29%)、101.68%(2.17%)。指纹图谱共标定出峰29个,其中黄酮峰25个,共有峰23个;同种产地样品相似度0.968~0.995。相对于云南叠鞘石斛叶,产地四川的黄酮类成分更多,芹菜素-6,8-二-C-葡萄苷含量较低,但芦丁、总黄酮含量更高。结论该方法专属性强,准确度高,分析速度快,可同时测定叠鞘石斛叶三种单一成分及总黄酮成分含量。建立的“点-线-面”质量分析体系可为其他中药材、中成药等黄酮类成分的定量检测和指纹图谱质量控制提供思路和方法。

抗糖性白内障候选Ⅰ类新药石斛滴眼液临床前质量控制、急毒及刺激性实验研究

该研究旨在建立石斛滴眼液的质量控制方法,并对其进行急性毒性、刺激性及过敏性评价,为其开发利用奠定基础。采用高效液相色谱法测定石斛滴眼液的主要成分石斛酚和丁香酸的含量,石斛酚和丁香酸质量浓度线性范围分别是0.0408～1.5300g·L-1(r=0.9999),0.1008～0.5040g·L-1(r=0.9999),平均回收率分别为100.8%,99.84%,RSD分别为1.4%,1.8%(n=9),样品溶液在室温72h内稳定。小鼠急性毒性实验结果显示石斛滴眼液对小鼠无毒性反应;单次给药和连续给药1周对家兔眼和皮肤的刺激性实验及豚鼠过敏性实验结果显示石斛滴眼液无眼刺激性和无皮肤刺激性及过敏性,表明石斛滴眼液安全、稳定,具有较好的成药性。

叠鞘石斛联苄类化合物的大孔树脂纯化工艺优选及抗氧化活性考察

目的:优选叠鞘石斛联苄类化合物的大孔树脂纯化工艺条件并考察其体外抗氧化活性。方法:以静态饱和吸附量和洗脱率为指标,通过静态吸附-洗脱试验筛选大孔树脂型号。采用单因素试验考察上样液质量浓度、上样量、乙醇体积分数、洗脱剂用量、上样流速及洗脱流速对纯化工艺的影响,通过体外抗氧化试验考察联苄类化合物的体外抗氧化能力。结果:HPD-300型树脂纯化联苄类化合物的效果最好,其最佳纯化工艺条件为上样液质量浓度9.04 g·L-1,上样量1.25 BV,上样流速0.5 mL·min-1,加水和70%乙醇各5 BV以1.0 mL·min-1的流速洗脱。纯化后联苄类化合物纯度达67.07%,较纯化前提高了4.25倍。联苄类化合物的纯化物和粗提物对超氧阴离子自由基的抗氧化活性以半数抑制浓度(IC50)表示分别为0.408,0.985 g·L-1,对羟自由基的IC50依次为7.856,7.827 g·L-1。结论:HPD-300型大孔吸附树脂对叠鞘石斛联苄类化合物的纯化效果较好,纯化物的体外抗氧化能力有所提高。

镧在UV-B应力下对迭鞘石斛生理及药用成分的影响

为考察镧对UV-B应力下的迭鞘石斛[Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.denneanum(Kerr)]生理及药用成分的影响,对UV-B辐射下的迭鞘石斛叶面喷施硝酸镧溶液,筛选出最适合迭鞘石斛生长的镧溶液浓度,并考察在此浓度作用下迭鞘石斛的生理、抗氧化酶活性及药用成分的变化.UV-B辐射按强度分为T1(1.8 mmol m-2 s-1)、T2(3.6 mmol m-2s-1)、T3(5.4 mmol m-2 s-1),辐射时间共12 d,每3 d检测一次.结果表明,与其他浓度的镧溶液相比,20 mg/L镧溶液能促进迭鞘石斛的光合色素含量显著增加,因此最适宜迭鞘石斛生长.当迭鞘石斛接受低剂量UV-B(1.8 mmol m-2 s-1)辐射时,处理9 d时,镧元素仍然能显著促进光合作用,但当辐射强度较大(5.4 mmol m-2s-1)时,镧元素能显著促进光合作用的时间则降低为6 d.当迭鞘石斛接受5.4 mmol m-2 s-1的UV-B辐射12 d时,同时喷施镧溶液能显著增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量,且显著增强过氧化氢酶(CAT)的活性,有利于缓解辐射造成的氧化伤害.当迭鞘石斛接受3.6 mmol m-2s-1 UV-B辐射3d时,喷施镧溶液能显著促进叶片中超氧化物歧化酶(SOD)活性,增强SOD清除超氧阴离子的能力.当迭鞘石斛接受低剂量(1.8 mmol m-2 s-1)UV-B辐射6 d,同时喷施镧溶液时,会显著促进多糖和多酚的积累,提升迭鞘石斛药用价值.本研究表明镧元素能有效保护UV-B辐射下的迭鞘石斛,并增加迭鞘石斛的药用价值.(图10参25)

叠鞘石斛的化学成分研究

目的研究叠鞘石斛Dendrobium aurantiacum var.denneanum药材的化学成分。方法应用硅胶、大孔吸附树脂AB-8、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及高效液相制备色谱等方法进行分离纯化,根据质谱和波谱数据鉴定化合物的结构,同时采用MTT法进行抗肿瘤活性筛选。结果从叠鞘石斛茎中分离鉴定了9个化合物,分别为(-)-(7R,7′R,8R,8′S)-4,4′-二羟基-3,3′,5,5′-四甲氧基-7,9′-环氧木脂烷-7′,9-内酯()、(-)-丁香脂素()、(-)-开环异落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷()、拖鞋状石斛素()、石斛酚()、杓唇石斛素()、(+)-柚皮素()、反式肉桂酸甲酯-2-O-β-D-葡萄糖苷()、香草酸()。其中,化合物对A549、Hep G2、A2780肿瘤细胞增殖具有不同程度的抑制作用,IC50分别为5.49、51.2、119.3μmol/L。结论化合物为新化合物,命名为石斛脂素;且对3种人肿瘤细胞具有一定的细胞毒作用。

Box-Behnken设计优化石斛清咽含片提取工艺

目的：优选石斛清咽含片的提取工艺.方法：采用HPLC测定石斛酚含量,检测波长278 nm,流动相乙腈（A）-0.5％甲酸（B）梯度洗脱（0 - 20 min,27％A;20 - 30 min,27％ - 40％A;30- 45 min,40％ - 65％A;45 - 50 min,65％ - 27％A）.以石斛酚提取量和干膏率的综合评分为指标,在单因素试验基础上,通过Box-Behnken试验考察提取时间、料液比、浸泡时间对提取工艺的影响.结果：最佳提取工艺为加11倍量水浸泡35 min,提取3次,每次1h;石斛酚提取量0.189 6 mg·g-1,干膏得率41.27％.结论：通过Box-Behnken效应面法及总评“归一值”为评价系统优选的提取工艺合理可行,为石斛清咽含片的应用提供参考.