秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生体系的建立

秋石斛(Phalaenopsis-hybrid Dendrobium)花姿优美、花色丰富,是热区重要观赏植物,具有极高的产业价值。本研究以秋石斛杂交种迷你(Den.Yaya Victoria)、水蜜桃(Den.Swirl)、三亚阳光(Den.Sonia Hiasakul)原球茎和无菌苗幼嫩茎段为外植体,探讨不同植物生长调节剂组合对不同品种秋石斛胚性愈伤诱导、不定芽分化及植株再生的影响。结果表明:在胚性愈伤组织诱导阶段,原球茎和生长2个月的幼苗茎段作为外植体诱导效果最佳,暗培养30 d即可获得胚性愈伤。3个品种的愈伤组织诱导最佳培养基是以MSD(MS+30 g/L葡萄糖+1 g/L花宝1号+8 g/L琼脂)为基本培养基,添加0.5 mg/L KT和0.2~0.5 mg/L 2,4-D。迷你、水蜜桃、三亚阳光的胚性愈伤诱导率最高分别为31.11%、22.78%和50%,其中迷你品种仅需15 d即可获得胚性愈伤。最佳胚性愈伤增殖培养基为MSD+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L KT,胚性愈伤状态保持良好且不发生分化,增殖倍数0.9。最佳分化培养基为1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.15 mg/L KT,在光照条件下,接种后的胚性愈伤组织能够快速诱导形成芽点,30 d内分化形成2~3片叶的幼苗,相同培养基中保持60 d能够自行生根获得完整再生苗。最佳生根培养基为1/2 MS+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L NAA+8 g/L琼脂,生根率为100%,平均生根数5条,根长约1.3 cm。本研究所使用的胚性愈伤组织诱导、增殖和分化培养基具有一定的广谱性,可为后续秋石斛胚再生途径及分子育种研究奠定基础。

铁皮石斛和红龙石斛杂交后代繁育技术研究

对铁皮石斛和红龙石斛杂交后代的繁育技术进行了研究。结果表明:以铁皮石斛为母本与红龙石斛杂交,成功率较高,达96.7%;其杂交后代的最佳播种培养基为HB01(含花宝1号3.0 g)+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,最佳增殖培养基为HB01+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L+香蕉50 g/L,最佳壮苗培养基为HB01+BA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉50 g/L,最佳生根培养基为HB01+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蛋白胨0.25 g/L;杂交后代组培苗的较佳移栽基质为刨花和5号树皮(直径0.8~1.2 cm);将稳定生长的杂交后代种苗连同基质在室外栽培,可营造热带园林景观,且种苗生性强健,较耐强光和干旱;扩繁杂交后代的优秀单株时宜选用幼嫩茎段作为外植体,并用0.1%氯化汞溶液对外植体消毒5 min,外植体萌芽的适宜培养基为HB01+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

石斛兰杂交后代SRAP鉴定与遗传多样性分析

以麝香石斛、檀香石斛及麝香石斛×檀香石斛的100个杂交后代株系为试材,采用SRAP分子标记的方法,研究了杂交后代的真实性及亲本与杂交后代群体的遗传多样性,以期为加速石斛兰新品种的选育提供参考依据。结果表明:综合6对SRAP引物组合的扩增情况,共鉴定出100个杂交后代为真杂种,鉴定效率达100%;6对SRAP引物组合的多态性比例达97.26%,多态性信息含量均值为0.85;由聚类分析可知,92%的杂交后代在亲缘关系上与父本聚为一类;由遗传相似系数分析可知,杂交后代与父本间的遗传相似系数平均值大于母本。综上所述,供试的麝香石斛×檀香石斛杂交后代均为真杂种,且表现为偏父本遗传,SRAP分子标记可作为石斛兰杂交后代早期鉴定的有效手段。

石斛新品种‘勐焕默雅’和‘彩瓣黄喉’

‘勐焕默雅’是以檀香石斛为母本,黄喉石斛为父本杂交选育出的新品种。其茎丛生,圆柱形,长46~67 cm,粗0.9~1.2 cm;叶长椭圆形,长9.1~11.5 cm,宽2.5~3.9 cm;花横径9.8~12.2 cm,萼片和花瓣紫红色,轻微扭曲,唇瓣喉部白色(2015RHS NN155D),花有淡淡檀香。‘彩瓣黄喉’是以黄喉石斛为母本,金钗石斛为父本杂交选育的新品种。其茎长36~47 cm,粗0.8~1.1 cm;叶长圆形,长8.6~12.1 cm,宽2.8~3.5 cm;花横径8.1~10.2 cm,萼片和花瓣浅紫红色(2015RHS 77B),扭曲程度弱。2个石斛新品种花期4—6月,带叶开花,适宜云南海拔1 000~1 500 m地区或温室种植。

3种杂交石斛种子无菌播种快繁技术

本文以梵净山石斛、矩唇石斛、喉红石斛、翅萼石斛、铁皮石斛和金钗石斛的杂交石斛种子为研究对象,对梵净山石斛(♀)×矩唇石斛(♂)、喉红石斛(♀)×翅萼石斛(♂)、铁皮石斛(♀)×金钗石斛(♂)3组石斛进行人工授粉种间杂交,对所得杂交石斛种子开展种子无菌萌发、杂交石斛种苗壮苗生根以及移栽驯化研究。结果表明:最适合3种杂交石斛种子无菌萌发的基本培养基均为1/2MS培养基;最佳壮苗生根培养基配方均为1/2MS+BA 0.1 mg·L^(-1)+NAA 0.5 mg·L^(-1)+100 g·L^(-1)马铃薯+0.5 g·L^(-1)活性炭;适宜移栽驯化的基质分别为优品兰土、精品兰土、优品兰土,成活率分别达到90.6%、62.5%、100%。通过人工授粉得到种子,以杂交石斛种子为外植体,可以建立杂交石斛快繁技术体系。

秋石斛兰F_1代主要观赏性状的遗传表现

以秋石斛兰为亲本,配制成6个杂交组合,对杂交F_1代的植株性状、花部性状和开花期进行统计分析。结果表明,杂种F_1代的株幅、叶宽、花梗长、花径等4个数量性状的平均值分别占中亲值的99.63%、96.18%、97.01%和99.77%,均较中亲值有所下降,表现出一定程度的衰退现象,但由于组合内存在一定的变异幅度,选育植株较大、花径较大或花梗更长的个体是可能的;在植株的株高、叶长、单枝花朵数、花色及始花期等方面表现出超亲优势,尤其是单枝花朵数和花色遗传优势明显;在花色遗传上,无论是以白色花还是以红色系列花作母本,F_1代均表现为红色系列且分离广泛,表明红色系列遗传能力更强。

霍山石斛杂交种与其亲本生长生理指标及药效成分含量的比较

目的:对霍山石斛杂交种与其亲本进行生长、生理指标及主要药效成分含量的比较,为霍山石斛种质资源改良提供理论依据。方法:叶绿素含量用无水乙醇法,光合速率用CI-310便携式光合作用测定系统测定;多糖含量用浓硫酸-苯酚比色法,总生物碱含量用溴甲酚绿酸性染料比色法测定。结果:杂交种生长量积累表现为近铜皮石斛的特性,较霍山石斛有极大优势;一年生杂交种叶绿素含量及光合速率均极显著高于其亲本;杂交种二年茎与三年茎多糖含量和总生物碱含量均与霍山石斛接近。结论:杂交种在生长和药效成分积累方面结合了2个亲本之间的优势,具有很大的开发利用前景。

秋石斛‘三亚阳光’中苗低温胁迫生理响应研究及耐寒指标筛选

对秋石斛‘三亚阳光’中苗进行15、10和5℃胁迫处理,测定各处理样品的电导率、可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素含量、恢复生长之后的落叶率等耐寒生理指标,分析这些耐寒指标在胁迫下的变化规律,筛选出有效的耐寒评价生理指标。结果表明,电导率及可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛含量和落叶率均随着处理温度的降低和处理时间的延长呈现上升趋势,而叶绿素含量则呈现逐渐下降的趋势。相关性分析发现,可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素含量和落叶率都与半致死温度有极显著的相关性,表明可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素含量和落叶率可作为秋石斛‘三亚阳光’耐寒性综合评价的有效评价指标。研究结果可以为秋石斛种质资源的耐寒性评价提供了理论依据和技术方法。

石斛兰“绿色星辰×出水芙蓉”杂交种子无菌萌发与组培快繁研究

[目的]研究石斛兰"绿色星辰×出水芙蓉"杂交种子无菌萌发与组培快繁。[方法]以"绿色星辰"为母本、"出水芙蓉"为父本进行杂交,并对其杂交种子进行了离体培养和组培快繁。[结果]石斛兰杂交种"绿色星辰×出水芙蓉"的F1代种子在改良Knudson培养基上(附加1.00 mg/L 6-BA、1.00 mg/L NAA和10.0%熟香蕉泥)可获得理想的无菌萌发效果,且原球茎在该培养基上也能较快增殖。以1/2MS最适合于该杂种石斛兰F1代无菌实生苗的组培快繁;8种供试培养基用于增殖培养的效果为:1/2MS>MS>1/3MS>1/4MS≈N6>改良Knudson≈B5>H。NAA用于杂种石斛兰"绿色星辰×出水芙蓉"F1代无菌实生苗的生根壮苗效果要优于IBA;NAA的推荐浓度为2.00 mg/L。[结论]为今后的新品种选育提供了育种材料。

霍山石斛杂交种与亲本有效成分积累规律的研究

[目的]研究了霍山石斛杂交种与其亲本在3年的生长周期中多糖、生物碱及可溶性蛋白质含量变化的规律,以期为霍山石斛种质资源改良和合理采收提供理论依据。[方法]多糖含量、总生物碱含量及可溶性蛋白质含量分别采用浓硫酸-苯酚比色法、溴甲酚绿酸性染料比色法、考马斯亮蓝G-250染色法测定。[结果]杂交种2年茎与3年茎多糖和总生物碱含量均与霍山石斛接近;杂交种及其亲本多糖含量均为2年茎最高,3年茎下降较大;生物碱含量在3年中均为逐年增高。[结论]杂交种（F1代）药效成分含量积累表现为近霍山石斛的特性。若依照不同的用药目的,则可于第2年或第3年采收,比民间传统的＂存三去四＂法可提前1-2年。

重唇石斛传粉生物学与显微动态研究

通过杂交和自交实验,对重唇石斛授粉亲和力和结实性进行分析,并对其开花期间花粉及蕊柱结构的动态变化进行显微观察,以探讨重唇石斛的最佳杂交授粉时间。结果表明：（1）花器表面结构差异较大,唇瓣、药帽、萼片表皮布满突起、钩刺等,花瓣表皮较平滑;（2）杂交时以重唇石斛为父本或母本均具有选择性,但作为父本亲和力强,杂交结实率可达100%,作为母本杂交结实率最高为60%;自交结实率非常低,为4.3%;（3）花粉培养的最佳配方为30%蔗糖＋0.15 mg.L-1CaCl2;（4）花开第4天后花粉发育饱满,第5-12天花粉发芽率稳定大于70%,蕊柱的乳突细胞于开花第6-10天时发育饱满。研究表明,重唇石斛花开第5-12天为最佳授粉时间。

NO对石斛类原球茎内源激素水平及生物碱积累的影响

以杂交石斛类原球茎为材料,硝普钠(SNP)为NO的供体,研究了SNP处理对石斛类原球茎的内源激素水平及生物碱积累的影响。结果表明,SNP处理促进了类原球茎生物碱的积累,处理组类原球茎的生物碱含量比对照提高了41.89%,但类原球茎生长受到一定的抑制;SNP处理刺激类原球茎内源激素水平升高,同时苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著增强,从而调控石斛类原球茎生物碱的积累;通径分析表明,多种内源激素通过相互作用调控石斛类原球茎生物碱的积累,水杨酸(SA)对生物碱含量的直接正效应排在首位。

石斛兰组织培养和细胞学观察

以石斛兰杂交种的茎尖、茎节和幼嫩小叶片作为外植体均可诱导出愈伤组织。愈伤组织在同一培养基上可同时出现不定芽和拟原球茎，两者都能进一步发育成完整幼苗。拟原球茎和不定芽分别来自愈伤组织的表层细胞和深层细胞。由愈伤组织、不定芽和拟原球茎交错在一起的团块可以多次切割继代培养，进行大量无性繁殖。

春石斛杂交育种及亲缘关系的AFLP分析

春石斛Dendrobium nobile为亚热带花卉。为了解决种苗依赖进口的问题,从2002年开始,从国内外引进春石斛资源,从中精选符合中国国情的花色品种和单株作为杂交育种材料,从2002-2006年授粉组合共计345个,成功育苗144个,成功率41.74%,所得杂交后代5029号和5041号2个最符合育种目标。对30个引进的品种和杂交获得的品种进行荧光AFLP(扩增片断长度多态性)分析,构建春石斛新品种的DNA指纹图谱,为品种鉴定、评价和品种创新、新品种保护提供可靠方便的技术手段。

^(60)Coγ辐照与NO复合处理对杂交石斛类原球茎生长和生物碱合成的影响

以杂交石斛类原球茎为材料,硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)为NO的供体,研究了60 Co γ辐照和SNP复合处理对石斛悬浮培养类原球茎的生长和生物碱合成的影响。结果表明,60Co γ和SNP单独或复合处理都能促进类原球茎生物碱的合成,且复合处理对石斛类原球茎生物碱的合成有一定的累加效应,但类原球茎生长减缓。适宜的复合处理组合为0.1mmol/L SNP+10Gy 60Co γ辐照,此时类原球茎生物碱含量高达0.0676%,与各因素单独处理差异显著,单位培养基生物碱产量为对照组的6.35倍。NO抑制剂L-NAME和cPTIO均能抑制各处理组合对类原球茎生物碱合成的促进作用。复合处理影响类原球茎抗氧化酶POD、SOD、CAT活性,从而调控石斛类原球茎生长和生物碱合成。

杂种石斛兰组织培养的研究

本文用引进的泰国石斛兰熊猫１号（ＰＡＮＤＡＮｏ．１）与熊猫２号（ＰＡＮＤＡＮｏ．２）杂交，并将杂交种子经组织培养，获得无病毒试管苗结果表明：在附加６－ＢＡ０．１～１ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ０．５～１．５ｍｇ／Ｌ的改良ＫＣ及改良ＭＳ培养基上，原球茎的发生率达９０％以上，增殖８～１０倍．生根壮苗培养阶段，以附加５％～１０％马铃薯提取液和５％～１０％香蕉汁（不加任何激素）的处理效果最佳．用冷开水代替蒸馏水，食用白糖代替试剂蔗糖，对杂交石斛兰试管苗的生长无明显影响．

基于iPBS标记的石斛兰杂交子代真实性鉴定

石斛兰为石斛属所有植物的总称,是兰科植物中重要的花卉资源,具有极高的观赏和药用价值。杂交育种是培育石斛兰新品种的主要方法,但石斛兰的育种年限较长,整个育种周期通常需要几年的时间。种质资源的鉴定是育种工作的基础,本研究对石斛兰杂交后代株系进行鉴定,以期为石斛兰杂种后代的早期选择及新品种(系)的快速鉴定提供分子依据,进一步缩短育种周期,加快石斛兰育种工作进程。iPBS标记作为一种新型的分子标记,无需预先获取LTR序列,相较于其他分子标记具有简单、高效且应用范围广等优点,本研究采用iPBS分子标记技术对广美石斛×黄钻戒石斛的19个杂种F_(1)株系进行杂种真实性鉴定,并进行遗传多样性和聚类分析。研究结果表明:从83条iPBS引物中筛选出7条扩增条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于石斛兰杂交子代真实性鉴定;7条引物共扩增出69条条带,其中多态性条带为51条,多态性比率为73.91%;较多的父本遗传信息导入子代个体中,供试的19个杂种F_(1)株系均能扩增出父本特征性条带,鉴定为真杂种;聚类分析表明,绝大多数杂交后代在亲缘关系上先倾向于父本后倾向于母本;遗传相似系数分析结果表明,杂交后代与父本的平均遗传相似系数大于母本,说明供试杂交后代在遗传上更倾向于父本,与聚类结果吻合;该杂交组合子代植株偏父本遗传。研究结果证明,iPBS分子标记技术可作为石斛兰杂交育种早期杂交种筛选鉴定的有效方法。该研究结果为进一步揭示石斛兰种群亲本与子代间的遗传多样性提供科学依据。

应用抑制性差减杂交技术构建铁皮石斛差减cDNA文库的探讨

[目的]探讨构建铁皮石斛抑制差减文库的方法,为克隆石斛碱生物合成相关功能基因奠定基础。[方法]采用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别以4年生和1年生铁皮石斛叶片互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为检测子(tester)与驱赶子(driver),将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(PointTMXa-1T-Vector),转化大肠杆菌JM109,聚合酶链反应(PCR)扩增鉴定插入片段。[结果]成功地构建了与石斛碱生物合成相关的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含560、220个重组子;插入片段的平均大小为550bp。[结论]所构建的差减cDNA文库适合进一步克隆分析石斛碱相关功能基因研究。

铁皮石斛自交和杂交亲和性的细胞学研究

为了探讨铁皮石斛Dendrobium officinale自交和杂交亲和性的生物学机制,利用荧光显微镜观察铁皮石斛自交、种内杂交后柱头性状和花粉管的生长情况。结果发现:自花授粉1 h后,花粉粒萌发,花粉管到达花柱基部接近子房处,4 h后花粉管进入子房,8 h后停止生长,72 h后子房萎缩,花粉管消失,不同的亲本间略有差别。种内杂交后的花粉管能够顺利进入子房,发育良好。由于铁皮石斛自交花粉管进入子房后停止生长,导致子房萎缩,可以认为铁皮石斛属于配子体自交不亲和。研究结果为铁皮石斛的自交不结实机理研究提供了细胞学基础,也为铁皮石斛种质资源保育、杂交育种等研究提供理论依据。

铁皮石斛与金钗石斛杂交及回交后代的SSR鉴定

[目的]鉴定铁皮石斛与金钗石斛杂交F1代和回交后代的真假性。[方法]以14株铁皮石斛与金钗石斛杂交F1后代及18株以铁皮石斛为母本回交后代为试验材料,从24对特异性SSR引物中筛选引物用以鉴定。[结果]从24对SSR基因组引物中,筛选出4对双亲多态性引物。用该4对石斛特异性引物可从14株杂交F1群体中鉴定出11株真杂交种,占杂交群体的78.6%;18株回交群体中,被4对引物同时鉴定出真杂种率达38.9%。[结论]利用SSR分子标记技术鉴定石斛种间杂交与回交是可行的,对提高石斛育种效率、缩短育种年限和石斛种质资源的保护与利用具有重要意义。