DNA防龋疫苗联合蛋白质疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的:研究以一种新型免疫策略即追加相应蛋白质抗原来加强免疫DNA疫苗的免疫效果。方法:重组质粒pCIA-P经鼻腔滴注途径免疫小鼠,并以其相应抗原rPAc蛋白或rPAc蛋白及黏膜佐剂rCTB经鼻腔滴注加强免疫,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平。结果:以rPAc蛋白或rPAc蛋白及黏膜佐剂rCTB加强免疫可显著提高唾液中IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体水平。并且以rPAc蛋白和黏膜佐剂rCTB加强免疫组产生了最高水平的唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体。结论:DNA防龋疫苗联合蛋白质疫苗可有效增强DNA防龋疫苗免疫效果。

GTF-PAc融合防龋DNA疫苗研究(Ⅲ)pGLUA-P免疫定菌鼠防龋研究

目的 :了解GTF -PAc融合防龋DNA疫苗 pGLUA -P激发机体免疫反应和抑制龋病的能力。 方法 :将pGLUA -P和携带 pac基因A -P基因片段的DNA防龋疫苗 pCIA -P以颌下腺周围区域皮下注射 (TSG)和股四头肌注射途径分别免疫定菌SD大鼠 ,以ELISA法检测血清和唾液中的抗体水平 ,采用Keyes法评估大鼠磨牙患龋情况。结果 :pGLUA -P和 pCIA -P经TSG免疫及 pGLUA -P经股四头肌注射免疫组的血清抗PAc的IgG抗体水平明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,pGLUA -P和pCIA -P经TSG免疫组的唾液抗PAc的IgA抗体水平明显高于其余组 (P <0 .0 5 ) ;pGLUA -P经TSG免疫组的釉质龋和牙本质浅龋记分最低 (P <0 .0 5 ) ;经TSG免疫 pGLUA-P组和pCIA -P组的牙本质中龋记分最低 (P <0 .0 5 )。结论 :GTF -PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA -P可以有效地诱导机体的免疫反应 ,抑制龋病的发生和发展 ,防龋效果优于防龋DNA疫苗 pCIA -P。

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。

靶向防龋DNA疫苗在小鼠体内的存留时间分析

目的:观察靶向防龋DNA疫苗pG JA-P/VAX免疫小鼠后在免疫原位和引流淋巴结的存留时间。方法:靶向防龋DNA疫苗pG JA-P/VAX分别经肌肉注射和鼻黏膜滴注途径免疫BALB/c小鼠。免疫后1、3、6个月,取肌肉注射组注射局部的肌肉组织和腹股沟引流淋巴结,鼻黏膜滴注组鼻相关淋巴组织和颈部引流淋巴结,提取基因组DNA,以其为模板采用PCR方法扩增pG JA-P/VAX中的GLU序列。结果:免疫后1、3、6个月,在免疫局部组织和引流淋巴结的基因组DNA中均扩增得到870 bp的片段,测序证实该片段序列与GLU序列一致。结论:防龋DNA疫苗pG JA-P/VAX免疫小鼠后,可在免疫原位和引流淋巴结较长期存在。

DNA防龋疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的 :观察编码pac结构基因A -P片段的重组质粒pCIA -P以不同途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应。方法 :重组质粒pCIA -P经鼻腔滴注和颌下腺区皮下腺注射两种途径免疫小鼠 ,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。结果 :滴鼻法和皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高 ,并持续数周。且滴鼻法比皮下注射法诱导唾液IgA型特异性抗体要早。结论 :重组质粒pCIA -P是一种有效的免疫原 ,滴鼻法和颌下区皮下注射法接种防龋DNA疫苗都可有效诱导机体全身及局部黏膜免疫应答。而滴鼻法较皮下注射法能更早诱导局部黏膜免疫应答。

鼠伤寒沙门菌细菌影负载防龋DNA疫苗对小鼠黏膜免疫效能的影响

目的分析鼠伤寒沙门菌(St)细菌影负载防龋DNA疫苗对黏膜免疫效能的影响。方法收集St减毒株J357,同时转入噬菌体Phi X基因E表达质粒与pREP4质粒,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导,收集负载防龋DNA疫苗。按照随机原则,将20只SPF级BALB/c雌性小鼠分为A组(布比卡因包裹p VXA1 5μg)、B组(布比卡因包裹p GJGLU/VAX 5μg)、C组(细菌影负载空载体p VXA1 5μg)、D组(细菌影负载防龋DNA疫苗p GJGLU/VAX 5μg)共4组经鼻免疫小鼠,每组均为5只。采用酶联免疫吸附试验对各组小鼠唾液抗体的产生情况进行检测。结果经IPTG诱导后,对照组细菌生长速度较快;而表达基因E经IPTG诱导后,大量细菌出现死亡,随着诱导时间的延长,细菌的死亡数量明显进一步增多。经IPTG诱导前,取携带基因E的St中J357活菌数为2×1012个/L;而经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,其活菌数仅为5×108个/L,表明大量细菌被杀死。经酶联免疫吸附试验检测结果发现,唾液总Ig A抗体水平在各组小鼠免疫前的比较,并无显著差异(P> 0. 05);相比A组,C、D组小鼠免疫后唾液总Ig A抗体水平均明显升高(P <0. 05);而C、D组唾液总Ig A抗体水平与B组比较,均无显著差异(P> 0. 05)。经酶联免疫吸附试验检测结果发现,各组小鼠免疫前均未检出唾液特异性抗葡聚糖结合区Ig A抗体;免疫后8周,D组唾液特异性抗葡聚糖结合区Ig A抗体水平较A、B、C组均明显升高(P <0. 05),而B组抗体水平与A、C组比较,均无显著差异(P> 0. 05)。结论经鼻黏膜途径免疫小鼠经St细菌影负载防龋DNA疫苗后可明显改善其免疫效能。

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。

防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX免疫小鼠后的抗DNA抗体检测

目的:检测防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX经鼻腔免疫和肌肉免疫后是否会产生抗DNA抗体。研究该疫苗是否会导致自身免疫性疾病。方法:提取纯化的质粒pGJA-P/VAX分别经鼻腔和肌肉免疫小鼠,于第0、2、4、8周取血清做抗DNA抗体检测实验(ELISA法)。结果:各实验组之间均无显著性差异,各组免疫前后及各组间比较(P>0.01)。结论:说明DNA疫苗pGJA-P/VAX及其载体pVAX1对小鼠均不会引起自身免疫反应,导致自身免疫病。

In Vivo Kinetics and Biodistribution of a Hantaan Virus DNA Vaccine after Intramuscular Injection in Mice

To study the kinetics in vivo of a Hantaan virus DNA vaccine, we constructed a fusion DNA vaccine, pEGFP/S, by cloning the S segment of Hantavirus into the vector, pEGFP-C1, which encodes Green fluorescent protein EGFP. In this report, we provide evidence that pEGFP/S was distributed and persistently expressed for more than 60 days in several organs after inoculation. Our findings suggest that the persistent immune responses induced by a Hantaan virus DNA vaccine are likely due to the plasmid pEGFP/S deposited in vivo, which acts as a booster immunization.

含变链菌SBR基因的双启动子质粒pCN-SSIE的构建及其免疫原性检测

目的:构建含有编码变形链球菌致龋毒力因子SBR基因的双启动子防龋DNA疫苗pCN-SSIE,以减毒沙门菌为载体进行高效黏膜免疫。方法:通过PCR扩增编码变形链球菌表面蛋白抗原的唾液结合区段(SBR)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将SBR基因插入到双启动子表达载体pCMVnir中,在SBR基因上游和下游依次插入人工合成的tPA信号肽基因序列、核糖体内部进入位点(IRES)基因和EGFP基因,构建质粒pCN-SSIE。通过DNA测序和酶切分析证明,双启动子表达质粒pCN-SSIE构建成功后,再用该质粒转化减毒沙门菌SL3261和转染CHO细胞,检测SBR在原核细胞和真核细胞中的表达状况,最后用pCN-SSIE裸质粒通过肌内注射免疫小鼠,检测其血清中的抗SBR特异抗体。结果:DNA测序和酶切分析均证明,构建的双启动子表达质粒pCN-SSIE开放读码框架正确;质粒在原核和真核细胞中均能正常表达;在免疫小鼠的血清中检测到了高水平的抗SBR特异IgG。结论:构建成功双启动子表达质粒pCN-SSIE,在体外真核和原核细胞中均能正常表达,用其作为DNA疫苗免疫动物,可诱导明显的免疫应答。

减毒鼠伤寒沙门菌防龋疫苗的免疫防龋效果

【目的】采用减毒鼠伤寒沙门菌S .typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)防龋疫苗经不同途径免疫定菌大鼠 ,观察其对变形链球菌在大鼠牙面黏附、龋病发生的影响等免疫防龋效果。【方法】将 5 0只大鼠随机分组 ,经口服、皮下、黏膜下途径免疫 ,接种变形链球菌并给予致龋饲料。对各组大鼠口腔中变形链球菌的定居菌落进行计数、黏附率计算 ,收集大鼠颌骨标本 ,根据Keyes评分标准作龋齿计分统计。【结果】口服活菌苗 S typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)组变形链球菌数为(3 4± 1 4)× 10 4 CFU ;磨牙龋齿Keyes计分总和为 30 7± 6 0 ,均明显低于其它组 (P <0 0 5 )。【结论】口服S typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)活菌苗可抑制变形链球菌黏附于牙面 ,并能减少龋病发生 ,具有较好的防龋效果。

两种GTF氨基催化区改良防龋质粒免疫小鼠的实验研究

目的:通过比较编码表兄链球菌葡糖基转移酶氨基催化区CAT不同形式基因序列的两种改良防龋质粒免疫BALB/c小鼠后激发的特异性抗体水平差异,初步评价不同形式CAT在DNA防龋疫苗中的应用潜力。方法:利用分子克隆技术构建两种改良防龋质粒,在靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中插入表兄链球菌OMZ176GTF-I CAT全基因序列构建pGJGAC/VAX;将基因公司合成的共计165bp的串联重复5次的GTF-I氨基催化区核心保守序列克隆到pGJA-P/VAX中构建pGJGA-5C/VAX。转染CHO细胞系,检测其表达。两种改良质粒经鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平。结果:重组质粒的基因序列与预期相符。不同形式CAT基因序列的两种改良防龋质粒均可在真核细胞正确表达。pGJGAC/VAX和pGJGA-5C/VAX免疫动物后血清和唾液特异性抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体均显著高于空载体pVAX1免疫组(P<0.05)。第10、12和14周,pGJGAC/VAX免疫组小鼠的血清特异性抗CAT抗体显著高于pGJGA-5C/VAX组(P<0.05)。两组间唾液特异性抗体未见显著性差异。pGJGA-5C/VAX在小鼠体内激发特异性抗体的速度较pGJGAC/VAX略快。结论:本实验构建的增加表兄链球菌GTF氨基催化区的两种改良防龋质粒,可在真核细胞中正确表达,两种质粒有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,pGJGAC/VAX和pGJGA-5C/VAX各有优势。

编码PAc结构基因的DNA疫苗免疫动物的实验研究

目的 本项研究将已构建的编码pac结构基因A P片段的重组质粒pCIA P免疫Wistar大鼠 ,观察重组表面蛋白抗原PAc在大鼠体内不同组织中的原位表达以及免疫定菌鼠后的防龋效果。方法 重组质粒pCIA P经股四头肌肌肉注射和颌下腺区皮下注射两种途径免疫大鼠 ,以免疫组化技术观察重组蛋白PAc在免疫部位的表达。采用股四头肌肌肉注射、颌下腺区皮下注射和颊粘膜下注射 3种方法免疫定菌鼠 ,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平 ,Keyes计分法评估免疫定菌鼠后鼠磨牙的患龋情况。结果 大鼠股四头肌细胞中可见PAc蛋白不均匀的受限表达 ,双侧颌下腺组织均可检测到PAc蛋白的阳性染色 ,在导管内表达呈强阳性。用重组质粒pCIA P经颌下腺区皮下注射和颊粘膜免疫的方法可显著增加唾液中抗PAc IgA水平和血清中特异性抗PAc IgG水平。重组质粒免疫定菌鼠后能显著降低定菌鼠龋损计分。特别是颌下腺区皮下和颊粘膜注射免疫组 ,大鼠牙本质龋的破坏程度明显低于其他组。结论 重组质粒pCIA P是一种有效的免疫原 ,粘膜免疫是较理想的DNA防龋疫苗的接种途径。

靶向融合防龋DNA疫苗的构建与体外细胞表达研究

目的 构建以人细胞毒性T淋巴细胞抗原 4 (cytotoxicTlymphocyte associatedantigen4 ,CTLA4 )为引导的抗变形链球菌 (Streptococcusmutans,S mutans)葡糖基转移酶(glucosyltransferase ,GTFs)Ⅰ和表面蛋白PAc的靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P ,检测其在真核细胞中的表达。方法 利用RT PCR方法从外周淋巴细胞中获得CTLA4胞外区和Igγ1 恒定区基因并进行T A克隆 ,获得携带CTLA4 Ig融合基因的重组质粒 pGJ,选择合适的酶切位点 ,再克隆入融合防龋DNA疫苗 pGLUA P中 ,构建靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P ,并转染CHO细胞系 ,用蛋白质免疫印迹实验检测其表达。结果 重组质粒 pGJ、pGJA P分别含有CTLA4 Igγ1 融合基因和CTLA4 、Igγ1 、pac、glu基因序列。蛋白质免疫印迹结果显示 ,pGJA P表达的抗原可以与特异性抗PAc抗体发生免疫反应。结论 成功构建了靶向融合防龋DNA疫苗 pGJA P 。

融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究

目的 将变形链球菌 (Streptococcusmutans)表面蛋白PAc编码A区和P区 (A P)的序列克隆到真核载体pGLU中 ,构建出GTF PAc融合防龋DNA疫苗 ,并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达。方法 将pCIA P质粒中A P片段序列与pGLU质粒连接 ,构建出GTF PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA P。将pGLUA P转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以SDS PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA P的表达。通过脂质体将pGLUA P转染大鼠原代肌母细胞 ,以免疫组织化学检测GLUA P的表达。结果 GTF PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA P经酶切分析证实携带GLU和A P片段。pGLUA P转化的大肠杆菌BL2 1 (DE3)经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白。pGLUA P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达。结论 成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA P ,所携带的基因序列正确 。

靶向融合防龋DNA疫苗免疫大鼠的研究

目的 检测靶向融合防龋DNA疫苗 pGJA P免疫大鼠后的原位表达。比较 pGJA P与融合防龋DNA疫苗pGLUA P免疫定菌鼠后产生的抗体水平和防龋效果。方法 质粒pGJA P分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫大鼠 ,免疫组化法检测重组蛋白在免疫部位的表达。建立定菌鼠模型 ,质粒pGJA P和 pGLUA P分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫定菌鼠 ,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗体水平 ,取上下颌骨进行Keyes龋齿记分。 结果 在 pGJA P肌肉免疫组的股四头肌和鼻腔免疫组的鼻腔黏膜检测到了表达的重组蛋白。pGJA P肌肉免疫组的血清抗PAc和抗GTFIgG滴度显著高于其他组 (P <0 0 1)。pGJA P肌肉免疫组和 pGJA P鼻腔免疫组的唾液抗PAc和抗GTFIgA滴度显著高于其他组 (P <0 0 1)。pGJA P免疫组的龋齿记分显著低于其他组 (P <0 0 1)。结论 pGJA P在动物体内能够正确表达。与pGLUA P相比 ,pGJA P能诱导更强的体液免疫反应 。

靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P免疫兔的实验研究

目的 体外检测靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P的免疫反应性 ;与非靶向融合防龋DNA疫苗 pGLUA P进行比较 ,评价其增强疫苗免疫效能的能力。 方法 将 pGJA P转染CHO细胞 ,蛋白质免疫印迹实验检测重组蛋白抗体免疫反应性。分 5组免疫兔 :pGJA P经肌肉注射组 (A组 ) ;pGJA P经鼻黏膜免疫组 (B组 ) ;pGLUA P经肌肉注射 (C组 ) ;pGLUA P经鼻黏膜免疫组 (D组 )和pCI载体经股四头肌注射组 (E组 )。酶联免疫吸附实验检测血清及唾液中的特异性抗体。用收集的血清进行葡糖基转移酶 (GTF)合成水不溶性葡聚糖抑制实验。结果 pGJA P表达的重组蛋白可以与抗GTF抗体反应。A组血清特异性IgG抗体水平远高于C组 (P <0 0 1) ;B组唾液特异性IgA抗体水平显著高于D组 (P <0 0 1) ;A组同样诱导了高水平的唾液特异性IgA抗体。A组的免疫血清抑制GTF活性的能力最强。结论 pGJA P具备GTF的免疫反应性 ;并较pGLUA P有更强的诱导系统和黏膜免疫反应及抑制GTF的能力。

编码基因pac的DNA疫苗经鼻粘膜免疫定菌鼠的研究

目的 检测pCIA PDNA防龋疫苗经鼻粘膜免疫定菌鼠的效果 ,并对两种不同的载体系统进行对比。方法 将 30只出生后 2 0d断乳的SD雌鼠随机分为 6组 ,制备定菌模型。分别用裸DNA(A组 )、DNA Dosper复合体 (B组 )、DNA Bupivacaine复合体 (C组 )、pCI质粒 (D组 )及无菌水 (E组 )经鼻粘膜免疫大鼠 ,裸DNA股四头肌注射 (F组 )为阳性对照。 2周后加强免疫 1次。 70d鼠龄时收集唾液、血清及粪便 ,酶联免疫吸附实验检测特异性抗体 ,处死大鼠进行Keyes记分 ,单因素方差分析法分析结果。结果 B、C、F组血清特异性抗PAcIgG水平和B、C组唾液中特异性抗PAcIgA抗体水平明显高于其他组 (P <0 0 1 )。疫苗免疫组龋齿记分明显低于阴性对照组 (P <0 0 1 ) ,其中B、C组效果最好。结论 编码基因pac的pCIA PDNA防龋疫苗经鼻粘膜途径进行免疫可以有效预防龋病的发生 。

变异链球菌、表兄链球菌复合防龋DNA疫苗的研制

目的构建包含变异链球菌和表兄链球菌两种致龋菌的主要抗原片段的复合防龋DNA疫苗，以期增强DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用。方法PCR获得表兄链球菌OMZ176GTF—I的CAT区，克隆至靶向防龋DNA疫苗pGJA—P／VAX中，构建编码变异链球菌PAc、GLU基因序列和表兄链球菌CAT基因序列的复合防龋DNA疫苗pGJGAC／VAX，转染CHO细胞系检测其表达。重组质粒及对照质粒分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫BALB／c小鼠，ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗PAc，抗GLU和抗CAT抗体水平。重组质粒及对照质粒经鼻腔滴注免疫分别定植了变异链球菌和表兄链球菌的Wistar大鼠，龋齿记分评价防龋疫苗的龋齿保护效能。结果重组质粒pGJGAC／VAX构建成功。免疫小鼠后实验组小鼠血清和唾液抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体水平均显著高于空载体对照组（P〈0．01）。血清特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现，分别为62．13μg/ml和11．43μg／ml；唾液特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现，分别为0．67％和0．80％。大鼠龋齿保护实验结果显示在变异链球菌和表兄链球菌定菌鼠中实验组釉质龋（E），牙本质浅龋（Ds）和牙本质中龋（Dm）均显著低于pVAX1免疫组（P〈0．05），实验组Ds和Dm均低于pGJA—P／VAX免疫组，但两组间E差异没有统计学意义（P〉0．05）。结论复合防龋DNA疫苗构建成功，可在真核细胞中正确表达，动物实验证实能有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应，并增强了DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用。

细胞毒淋巴细胞相关抗原4靶向防龋DNA疫苗在细胞中的表达研究

目的采用绿色荧光蛋白标记技术,研究细胞毒淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)靶向DNA疫苗编码抗原在细胞中表达的一般形式,并探讨CTLA-4融合抗原片段大小对靶向DNA疫苗在细胞中表达水平的影响。方法从靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P中去掉A-P片段,构建出靶向防龋质粒pGJGLU;以pVAX1质粒骨架替代pGJA-P和pGJGLU质粒中的pCI载体骨架,构建出pGJA-P/VAX和pGJGLU/VAX真核表达质粒;切下pGJGLU质粒的CTLA-4-Ig-GLU片段,克隆入pEGFP-N1中,获得pGJGLU/GFP质粒,转染CHO细胞,荧光显微镜下观察蛋白表达;将pGJA-P/VAX、pGJGLU/VAX和pGJGLU/GFP转染CHO细胞,以ELISA法检测培养上清液中融合蛋白的表达水平。结果pGJGLU/GFP转染细胞镜下表达特异性绿色荧光物质,呈颗粒状;pGJA-P/VAX、pGJGLU/VAX和pGJGLU/GFP3种质粒可以表达融合蛋白并分泌到培养上清液中,且所表达的融合蛋白浓度不同,并以pGJGLU/VAX表达的水平最高。结论CTLA-4融合蛋白可以以分泌形式表达,CTLA-4靶向疫苗编码的融合抗原片段大小影响其在细胞中的表达分泌水平。