Mineralized and Osteoid Tissue from Dental Pulp Stem Cells on Micro-arc Oxidation Titanium in vitro

The presence of insufficient bone volume affects the implant healing and success.The aim of this study was to evaluate osteogenic capacity of dental pulp stem cells(DPSCs) on micro-arc oxidation(MAO) titanium surface.DPSCs were challenged at MAO and smooth titanium surface separately for different durations,and the bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) served as the positive controls.The osteogenic capacity of DPSCs on MAO titanium surface was assessed by using scanning electron microscopy,energy dispersive spectroscopy,biochemical tests and real-time quantitative PCR.Data showed that DPSCs differentiated into osteoblasts and expressed bone morphogenetic genes on MAO titanium surface.The results of this study revealed that DPSCs had good potential to generate mineralized tissue on MAO titanium plates.The differential potential of DPSCs may be regulated by MAO titanium surface.The osteogenesis potential of DPSCs on the MAO titanium was similar with BMSCs.

骨桥蛋白影响矿化液诱导牙髓干细胞成骨分化能力的研究

目的研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对矿化液诱导牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨分化能力的影响,并优化其诱导条件。方法矿化液培养DPSCs作为对照组,在矿化液培养基础上添加适宜浓度OPN作为实验组,在倒置相差显微镜下观察诱导后的DPSCs形态变化;应用茜素红染色法检测矿化结节的形成;采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-RCR)分别检测DPSCs骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨钙蛋白(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-1)等骨源性基因表达情况。结果茜素红染色显示诱导培养28 d后两组均出现矿化结节,且实验组的数量和大小明显高于对照组。培养7 d后两组DPSCs骨源性基因表达均成阳性,且实验组中BSP、Runx-2、Col-1及OCN等基因表达水平均明显高于对照组。结论 OPN能增强矿化液诱导DPSCs成骨分化的能力。

重组hFOXA2和hPDX1慢病毒载体诱导乳牙牙髓干细胞重编程为胰岛素生成样细胞

目的:构建重组转录因子hFOXA2和hPDX1慢病毒载体,转染乳牙牙髓干细胞,诱导其向胰岛素生成样细胞(insulin-producing cells,IPCs)分化。方法:酶消化法分离培养人牙髓干细胞(DPSCs),有限稀释法纯化培养,流式细胞术分析细胞表面标志,并进行体外多向分化诱导验证;构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,Lipofectamine2000转染293T细胞进行病毒包装,通过荧光细胞计数测定病毒感染效率和滴度;以最佳感染复数(MOI)感染牙髓干细胞,诱导其体外重编程为胰岛素生成样细胞,免疫荧光染色测定PDX1、FOXA2及胰岛素原表达,ELISA法检测胰岛素分泌情况。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:体外成功分离培养人DPSCs;细胞表面表达STRO-1(98.01%)、CDl46(98.51%)、CD34(99.54%)和CD45(24.08%)。体外成骨、成软骨、成脂肪诱导分化特异性染色阳性;成功构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,双酶切和测序鉴定与GenBank的序列完全符合;病毒包装效率分别为(96.15±0.17)%和(95.49±0.21)%,感染滴度约为1.80×108GTU/mL,最佳MOI为20;诱导后的细胞表达胰岛素原、FOXA2和PDX1,胰岛素分泌量为1.92μmol/L,较未诱导组和对照组均显著增高(P<0.01)。结论:DPSCs经重组转录因子慢病毒载体Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1转染诱导,可启动细胞重编程机制,形成胰岛素生成样细胞,可作为糖尿病基因治疗的种子细胞。

矿化液对人牙髓干细胞生物学特性的影响

目的探讨矿化液对人牙髓干细胞(DPSCs)生长特性的影响。方法用含一定浓度的β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松的矿化液诱导人牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、vonKossa染色方法,观察和检测矿化液诱导后细胞形态、超微结构、表型和矿化基质分泌的变化,以未诱导组为对照。结果矿化液连续培养7d,人DPSCs细胞形态明显改变,呈牙本质样极化细胞表现,另一侧为增大的胞体;超微结构显示,诱导后的细胞体积增大,核浆比例下降,胞浆细胞器丰富;诱导前细胞不表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OC),诱导后均表达;连续培养21d,诱导组细胞形成多个矿化结节。结论矿化液能诱导人DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化并产生矿化基质。本研究从细胞水平上揭示了人DPSCs向成牙本质细胞分化机理,为人DPSCs应用于牙髓损伤的修复再生提供了依据。

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1(Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h PDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用。方法:体外分离培养h PDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率。采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平。对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调。结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用。

大鼠牙髓干细胞的分离培养与鉴定

目的:分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定。方法:采用酶消化法分离获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法纯化细胞,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,抗波形丝蛋白及角蛋白、抗STRO-1免疫化学染色。体外分化诱导实验检测细胞的多向分化能力。结果:分离纯化获得的大鼠牙髓干细胞在体外具有一定的克隆形成能力,波形丝蛋白、STRO-1均有表达。诱导条件下部分牙髓干细胞具有多向分化的潜力,符合干细胞特征。结论:成功从大鼠牙髓中获取牙髓干细胞。

乳牙与恒牙牙髓干细胞成血管能力的比较

目的:探讨乳牙牙髓干细胞(SHED)和恒牙牙髓干细胞(DPSCs)成血管能力的差异。方法:体外分离培养SHED和DPSCs,采用CCK8和划痕实验检测两种细胞的增殖和迁移能力,Matrigel小管形成实验、RT-PCR以及Western blot检测成血管诱导后两种细胞的成血管情况。结果:SHED较DPSCs的增殖、迁移能力强,SHED较DPSCs在基质胶上形成更多的类血管样结构,SHED较DPSCs更高表达成血管相关基因(P<0.05)和成血管相关蛋白。结论:SHED较DPSCs具有更强的增殖、迁移及成血管能力。

阿司匹林对人牙髓干细胞体外增殖、分化的影响及分子机制的研究

目的:探讨阿司匹林对人牙髓干细胞(h DPSCs)在体外增殖及分化过程的作用。方法:取体外培养的h DPSCs,加入矿化液和0.005、0.05、0.5、5 mmol/L的阿司匹林为实验组;单独加矿化液为对照组;不加矿化液为空白组。MTT法检测细胞增殖;在矿化液条件下阿司匹林诱导14 d时,茜素红染色观察细胞矿化情况,用western blot检测MAPK信号通路在h DPSCs分化中的作用。结果:0.05、0.005 mmol/L的阿司匹林均可促进h DPSCs增殖,5 mmol/L的阿司匹林则明显抑制h DPSCs的增殖;0.5、0.05 mmol/L的阿司匹林可抑制h DPSCs矿化结节的形成。Western blot结果显示,0.5 mmol/L阿司匹林刺激可抑制p-p38、p-JNK的表达且与作用时间相关,而对p-ERK表达无明显影响。结论:阿司匹林对h DPSCs的作用有剂量依赖性。阿司匹林可能是通过抑制MAPK的p38、JNK信号通路而抑制h DPSCs成牙向分化。

miR-210促进大鼠牙髓干细胞的增殖和牙源性分化

背景:miR NA表达谱预测miR-210可能在牙髓干细胞向牙本质和成骨方向分化中发挥作用,但具体作用尚不明确。目的:探讨miR-210在大鼠牙髓干细胞增殖和牙源性分化中的作用。方法:经河南中医药大学第二附属医院伦理委员会批准,收集5只SD大鼠牙髓组织,分离获得牙髓干细胞并分为5组:正常对照组、miR-210模拟物阴性对照组、miR-210模拟物组、miR-210抑制物阴性对照组和miR-210抑制物组。实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞中miR-210、ALP、DSPP、DMP-1、GIT2、OPNmR NA的表达和DSPP、DMP-1、OPN和OCN蛋白的表达,CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖能力,比色法检测细胞碱性磷酸酶活性,茜素红染色检测矿物质合成能力。结果与结论:(1)miR-210模拟物组细胞的增殖活力高于其他4组,差异有显著性意义(P <0.01);miR-210抑制物组细胞的增殖活力低于其他4组,差异有显著性意义(P <0.01);(2)miR-210模拟物组细胞的碱性磷酸酶活性高于其他4组,差异有显著性意义(P <0.01);miR-210抑制物组细胞的碱性磷酸酶活性低于其他4组,差异有显著性意义(P <0.01);(3)茜素红染色结果显示,miR-210模拟物组细胞表面布满钙盐沉积形成的大小不等的暗红色结节,数量多于其他4组,miR-210抑制物组细胞表面的暗红色钙结节散在分布,数量少于其他4组;(4)miR-210模拟物组细胞中miR-210、ALP、DSPP、DMP1、GIT2、OPN mRNA和DSPP、DMP1、OPN、OCN蛋白的表达高于其他4组,差异有显著性意义(P <0.01);miR-210抑制物组细胞中miR-210、ALP、DSPP、DMP1、GIT2、OPN mRNA和DSPP、DMP1、OPN、OCN蛋白的表达低于其他4组,差异有显著性意义(P <0.01);(5)结果提示,miR-210能够促进大鼠牙髓干细胞增殖与牙源性分化。

lncRNA TUG1对人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化的影响

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)牛磺酸上调基因1(taurine upregulated 1,TUG1)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖及成骨/牙本质向分化的影响。方法分离培养hDPSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素红染色鉴定其分化能力。hDPSCs成骨诱导0、7、14 d收集RNA,qRT-PCR检测TUG1的表达水平。构建携带sh-TUG1的慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA(TUG1)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE,并通过感染hDPSCs及嘌呤霉素筛选建立稳定沉默TUG1的hDPSCs细胞系,CCK-8检测hDPSCs增殖能力,ALP和茜素红染色及定量检测hDPSCs的早期ALP活性和晚期矿化结节的形成,qRT-PCR和Western blot检测成牙本质及成骨分化相关的基因牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentine matrix protein 1,DMP-1)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因及蛋白表达变化。结果成功分离、培养和鉴定hDPSCs,hDPSCs成骨向分化过程中TUG1的表达明显增加(P<0.05)。沉默TUG1后hDPSCs的增殖能力下降(P<0.05),ALP活性降低,矿化结节形成减少;成牙本质分化基因DSPP、DMP-1以及成骨分化基因Runx2、OCN、OPN表达也显著降低(P<0.05)。结论沉默TUG1可抑制hDPSCs的增殖及成骨/成牙本质分化。

人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究

目的体外培养人牙髓细胞，分选牙髓干细胞并诱导其分化。方法选择因正畸目的而拔除的健康完整双尖牙，酶消化法进行牙髓细胞培养，并进行来源鉴定。单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选。矿化液定向诱导分选后的牙髓干细胞，比较诱导前后stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶（ALP）的改变。结果体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样，抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性。牙髓干细胞Stro-1检测阳性，牙髓细胞中干细胞阳性率约为10％。矿化诱导后细胞stro-1阴性、ALP阳性表达。结论采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞，初步验证干细胞分化潜能，为其后续生物学特性研究提供实验基础。

低氧环境下Notch信号通路对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响

目的探讨低氧环境下通过低氧诱导因子-1α(HIF-1α)调控Notch信号通路对人牙髓干细胞(HDPSC)成牙本质向分化能力的影响。方法组织块酶消化法培养HDPSC,给予氯化钴(CoCl2)诱导的化学性低氧环境,Western blot检测HIF-1α蛋白表达,茜素红染色检测细胞矿化结节形成能力,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Notch下游靶基因Hes1与成牙本质相关基因的表达;进一步加入Notch信号通路特异性阻断剂γ分泌酶抑制剂(GSI),观察以上指标的变化。报告基因方法检测HIF-1α对Notch信号通路的调控作用。采用R version 3.5.3软件进行统计分析,计量资料进行正态检验,多组间比较采用单因素方差分析(方差齐)或Kruskal-Wallis H检验(方差不齐),两两比较采用LSD-t检验(方差齐)或Mann-Whitney U检验(方差不齐)。结果(1)Co Cl2诱导的低氧条件下HDPSC中的HIF-1α蛋白水平上调,Notch下游靶基因Hes1 mRNA相对表达量为1.46±0.12,相比常氧组(1.06±0.09)显著增高(t=-4.64,P=0.012);GSI处理阻断Notch信号通路后,低氧条件下HDPSC中HIF-1α蛋白水平下调,Hes1 mRNA相对表达量降低至0.82±0.14,与处理前相比差异有统计学意义(t=5.98,P=0.004);常氧条件下GSI处理后的HDPSC中HIF-1α蛋白水平也明显下调,Hes1 mRNA相对表达量(0.30±0.09)相比处理前也显著降低(t=10.08,P=0.001);(2)矿化诱导后的茜素红染色结果显示:低氧处理后,HDPSC细胞成牙本质分化能力下降;GSI处理后,成牙本质向分化能力增强。成骨/牙本质相关基因m RNA表达水平检测结果显示:低氧处理后,BSP、OCN和DSPP的m RNA相对表达量分别为0.53±0.14、0.43±0.20、0.48±0.11,相比常氧组(1.21±0.12、1.08±0.19、1.03±0.13)显著降低(tBSP=6.30,PBSP=0.003;tOCN=4.07,POCN=0.015;tDSPP=5.67,PDSPP=0.005);GSI处理后,低氧条件下BSP、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别为0.99±0.13、1.09±0.13、0.95±0.16,与处理前相比显著增高(tBSP=-4.17,PBSP=0.014;tOCN=-4.83,POCN=0.012;tDSPP=-4.30,PDSPP=0.017),常氧条件下BSP、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别为1.73±0.20、1.55±0.08、1.52±0.14,与处理前相比显著增高(tBSP=-3.84,PBSP=0.027;tOCN=-3.99,POCN=0.035;tDSPP=-4.43,PDSPP=0.011)。(3)荧光素酶报告基因结果显示,HIF-1α可调控NICD启动子,使双荧光素酶相对表达活性为5.37±0.12,与对照组(2.09±0.15)相比显著增强(t=-28.92,P<0.001),提示HIF-1α可能使Notch信号通路激活。结论低氧引起HDPSC中HIF-1α升高并可能通过激活Notch信号通路抑制其成牙本质向分化能力。

一种实验性MTA对人牙髓干细胞分化的影响

目的:探究Neo MTA对人牙髓干细胞的细胞外矿化的影响。方法:将50 mg/mL抗坏血酸,10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和100 nmol/L地塞米松加入含10%胎牛血清的α-MEM中制备矿化诱导液,在Transwell中放入Neo MTA样本,诱导人牙髓干细胞分化,达到指定天数后收集细胞,利用衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)技术检测细胞外基质形成。结果:与空白对照组相比,Neo MTA组中磷酸盐与胶原酰胺Ⅰ比率较高。结论:Neo MTA可以促进人牙髓干细胞分化过程中细胞外基质的形成。