小鼠牙本质涎磷蛋白基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠牙本质涎磷蛋白编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-DSPP。方法将质粒pTRE2-DSPP中的小鼠DSPP编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-DSPP,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-DSPP经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带DSPP基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,DSPP基因测序鉴定与genebank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/ml。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-DSPP,通过该系统携带的标记基因GFP可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究牙本质涎磷蛋白在牙齿发育中的作用奠定了基础。