粉尘螨Der f2变应原的分离纯化及其特征

目的 用粉尘螨 (Dermatophagoidesfarinae)代谢培养基浸液 (Dff)分离纯化粉尘螨 2类变应原 (Derf2 )。 方法 采用SephadexG 10 0层析、DEAE离子交换层析、PAGE等方法分离纯化Derf2 ,并对Derf2作SDS PAGE测定和热稳定性测定。结果 从Dff分离纯化得到较纯的Derf2 ,经SDS PAGE测定其相对分子质量为 140 0 0 ,并经 10 0℃加热 15min后 ,仍保留 5 0 %～ 83.3 %生物学活性。结论 从Dff中分离纯化的变应原 。

粉尘螨主要变应原基因Der f2和Der f3基因改组的优化

目的优化粉尘螨变应原Derf2和Derf3基因改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法 RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Derf2和Derf3基因,用DnaseⅠ分别酶解Derf2和Derf3基因10、15、20、25、30min;酶解相同时间的Derf2和Derf3基因两两混合,采用DNA shuffling技术对粉尘螨变应原Derf2和Derf3基因进行重组,电泳检测重组子。结果以Derf1F和Derf1 R、Derf2 F和Derf2 R为引物分别在酶切10min、15min、20min、25min均可扩增出清晰条带;以Derf2 F和Der f3 R为引物在酶切10min、15min和30min的模板中亦出现PCR片段。结论通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原Derf2和Derf3基因间的融合基因,为大规模制备高效,低价的哮喘疫苗奠定基础。

Der f2重组蛋白用于变应性鼻炎患者血清ELISA检测

目的:以重组表达的野生型粉尘螨变应原蛋白质第2组(Derf2)分作为固相包被抗原,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法,检测粉尘螨致敏的持续性变应性鼻炎患者血清中的特异性IgE浓度。方法:经过皮肤点刺试验证明的24例粉尘螨反应阳性血清和2例阴性血清作为IgE血清样本。以粉尘螨变应原蛋白质第2组分固相包被酶标板,辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgE单抗作为第2抗体组成测试系统分析特异性IgE。结果:间接ELISA系统检测灵敏度为0.73U.mL-1。在4.0U.mL-1、12.0U.mL-1、22.0U.mL-1浓度,批内重复性和批间重复性分别为9.5%,7%,6.1%和12.8%,9.1%,7.2%。24例皮试阳性患者血清经ELISA分析,有22例阳性。结论:以粉尘螨变应原蛋白质第2组分作为固相包被抗原的间接ELISA法可用来对患者血清sIgE作定量或定性分析,有助于持续性变应性鼻炎的实验诊断。

重组粉尘螨抗原纳米疫苗PLGA-Der f2免疫治疗小鼠过敏性哮喘的实验研究

目的探讨粉尘螨抗原纳米疫苗PLGA-Der f2免疫治疗小鼠过敏性哮喘的疗效及机制。方法使用PLGA包裹重组粉尘螨抗原Der f2构建纳米疫苗PLGA-Der f2。将雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组(PBS组,n=32)和致敏组(n=32),致敏组再分为哮喘模型组(Asthma组,n=8)、空纳米对照组(PLGA组,n=8)、重组粉尘螨抗原Der f2免疫治疗组(Der f2组,n=8)、PLGA-Der f2纳米疫苗免疫治疗组(PLGA-Der f2组,n=8)。使用粉尘螨粗提液分别对致敏组各组BALB/c小鼠进行致敏、激发,检测各组小鼠气道高反应性;通过HE染色观察小鼠肺部炎症浸润情况;比较小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL F)中细胞总数和嗜酸性粒细胞数量;使用酶联免疫吸附测定法测定小鼠肺组织研磨上清及脾细胞培养上清中的细胞因子IL-4、IL-13以及血清中的尘螨抗原特异性IgE抗体(sIgE)。结果与Asthma组和PLGA组相比:Der f2组和PLGA-Der f2组小鼠气道高反应性Penh值明显降低(均P<0.05),肺部炎症浸润显著减轻;BAL F中细胞总数(P<0.05)、嗜酸性粒细胞数量减少(P<0.05),血清中抗sIgE显著降低(P<0.05);肺组织研磨上清和脾细胞培养上清中IL-4、IL-13均明显降低(均P<0.05)。与粉尘螨抗原Der f2相比,PLGA-Der f2纳米疫苗治疗作用更强(均P<0.05)。结论粉尘螨抗原PLGA-Der f2纳米疫苗免疫治疗作用强于单独使用粉尘螨抗原Der f2。