粉尘螨变应原Derf1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化粉尘螨主要变应原Der f1重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:大量诱导表达含pET-28a(+)-Der f1质粒的BL21菌株,SDS-PAGE电泳并割胶纯化目的蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔,收集血清进行效价检测并用Western blot检测其特异性。结果:割胶回收可有效纯化Der f1重组蛋白,抗Der f1抗体效价为1∶32 000。结论:成功制备Der f1多克隆抗体,以期为尘螨过敏性疾病的诊断和免疫治疗提供参考。

尘螨1类变应原Derf1和Derp1生物信息学分析

目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的:构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果:将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论:成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。

粉尘螨I类变应原基因的多态性分析及表达蛋白的特性鉴定

目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。

粉尘螨过敏患者Der f 1和Der f 2特异性IgE的检测分析

为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本,进一步检测其粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平.80例样本中2种方法检测粉尘螨均为阳性的有65例,阳性率为81.3%.65例阳性样本中,Der f 1阳性率为87.7%,Der f 2阳性率为90.8%,二者至少一个为阳性的达96.99%,Der f 2特异性IgE水平显著高于Der f 1.儿童的粉尘螨及其2种单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平显著高于成人.综上,Der f 1和Der f 2这2种组分过敏原在我国粉尘螨患者中占据了主导地位,两者特异性IgE水平存在显著差异,后者高于前者,且儿童的敏感性显著高于成人.

不同尘螨过敏原诱导组胺释放能力分析

目的:研究用肥大细胞组胺体外定向释放模型分析重组尘螨过敏原Derf1和Derf2的致敏差异性。方法:用重组尘螨致敏原Derf1、Derf2免疫C57/BL6小鼠,收集小鼠腹腔致敏肥大细胞(PMC),在96酶标板孔中分别按不同比例混合尘螨致敏组分诱导PMC定向释放组胺,荧光法检测其释放水平。结果:Derf1、Derf2及两者的混合物都能引起PMC释放组胺,其致敏效果Derf2明显高于Derf1,Derf1、Derf2混合致敏组胺释放量未见高于单组分致敏者。牛奶和虾的粗提液与空白对照不能引起PMC组胺的明显释放。结论:尘螨混合组分未能引起比单独Derf1或Derf2强的组胺释放,两者间不存在协同效应。组胺释放量随Derf2比例升高而升高,推测在尘螨过敏中Derf2起主要作用。尘螨与牛奶、虾之间不存在交叉反应。

尘螨变应原Der f1植物表达载体的构建及表达

目的:构建尘螨变应原Der f1植物表达载体并侵染烟草叶片表达。方法:从保存的含pET28a(+)-Der f1的甘油菌株中扩增Der f1基因,并克隆到质粒载体中,提取质粒,进行测序;以ClaⅠ、SalⅠ双酶切,将Der f1基因克隆到马铃薯X病毒(PVX)载体中,构建植物病毒表达载体;将PVX-Der f1转化脓杆菌,挑取Kan、Tet抗性阳性的菌株侵染烟草叶片进行蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定和分析。结果:经SDS-PAGE分析,有4株烟草叶片蛋白提取物在34Mr处有特异性蛋白条带;经Western blot进一步验证其变应原,结果显示,烟草叶片中获得的重组蛋白在34Mr处与阳性血清发生特异性结合,而与阴性血清并不发生结合。结论:成功构建了植物病毒表达载体PVX-Der f1并获得表达,为尘螨变应原Der f1的研究提供新思路。

粉尘螨主要变应原基因Der f1和Der f3改组的研究

目的:探索粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f1和Der f3基因片段两两混合,采用DNAshuffling技术对粉尘螨变应原Der f1和Der f3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子。结果:以Der f 2 F和Der f2 R为引物在酶切10、15、20、25、30min均可扩增出清晰条带;以Der f1 F和Der f1 R、Der f1 F和Der f2 R、Der f2 F和Der f1 R为引物在酶切10、15、20、25、30min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带。结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础。