离子交换介孔分子筛DEAE-SBA-15的制备及其用于分离纯化粉尘螨主要变应原Derf2

通过3-含氧缩水甘油基-丙基-三甲氧基硅烷(GPTS)将二乙胺基乙基(DEAE)嫁接在介孔分子筛SBA-15的表面,制得弱阴离子交换层析剂DEAE-SBA-15,使其既具有分子筛作用,又具有离子交换作用的特点.经DEAE-SBA-15层析后,从粉尘螨代谢培养基中获得单一的洗脱峰,SDS-PAGE显示一条谱带,其相对分子质量为14000,表明经分离纯化所得到的蛋白质是粉尘螨主要变应原Derf2.对螨性哮喘患者皮肤点刺试验表明,所得Derf2仍具有变应原活性,且仅通过一次柱色谱即得Derf2,表明DEAE-SBA-15是一种较好的离子交换层析剂.

尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析

目的:获得尘螨变应原Derf2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Derf2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-Tsimple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Derf2cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Derf2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.

粉尘螨过敏患者Der f 1和Der f 2特异性IgE的检测分析

为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本,进一步检测其粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平.80例样本中2种方法检测粉尘螨均为阳性的有65例,阳性率为81.3%.65例阳性样本中,Der f 1阳性率为87.7%,Der f 2阳性率为90.8%,二者至少一个为阳性的达96.99%,Der f 2特异性IgE水平显著高于Der f 1.儿童的粉尘螨及其2种单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平显著高于成人.综上,Der f 1和Der f 2这2种组分过敏原在我国粉尘螨患者中占据了主导地位,两者特异性IgE水平存在显著差异,后者高于前者,且儿童的敏感性显著高于成人.

户尘螨Ⅱ类变应原Der p2 T细胞表位融合基因的克隆和原核表达

目的 原核表达、纯化户尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）主要变应原Der p2的T细胞表位融合肽。 方法 将已报道的户尘螨Der p2中编码4个T细胞表位（T1-T4）的核苷酸序列以T1-T2-T3-T4的方式连接，人工合成为嵌合基因，命名为Der p2 T。PCR扩增目的基因Der p2 T，将纯化的扩增片段克隆至pET-28a（＋）载体，构建原核重组表达质粒pET-28a（＋）-Der p2 T，并进行双酶切验证。大量诱导表达含pET-28a（＋）-Der p2 T的E. coli BL-21菌株，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经Ni-NTA亲和层析获得纯化重组蛋白，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析。ELISA法检测重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力。 结果 双酶切结果表明，构建了原核重组表达质粒pET-28a（＋）-Der p2 T。SDS-PAGE分析结果显示，获得相对分子质量（Mr）为10 000的重组Der p2 T细胞表位融合肽。Western blotting分析结果显示，纯化了Der p2的T细胞表位融合肽。Der p2 T细胞表位融合肽对粉尘螨哮喘患者的血清IgE结合能力［（37.70±9.89）μg/ml］较Der p2显著降低［（85.89±9.63）μg/ml］（P＜0.01）。 结论 制备Der p2 T细胞表位融合肽。与Der p2相比，重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力明显降低。

Indoor Allergen Levels and Household Distributions in Nine Cities Across China

Objective Chinese allergic subjects have high levels of sensitization to house dust mite （HDM） and other indoor allergens. This study quantifies common indoor allergen levels in Chinese households. Methods Dust samples were collected from nine cities. Major allergens Der p 1 and Der f I from Dermatophagoides pteronyssinus and D. farinae, and specific antigens of Blomia tropicalis, Tyrophagus putrescentiae, Acarus siro, and cockroach species Blattella germanica and Periplaneta americana were measured by ELISA.Results HDM allergens were found in dust samples from bedding in 95% of the Chinese households. The median levels varied from 〈0.006 to 9.2 μg/g of dust, depending on the city. The percentages of households having HDM allergen levels associated with the risk of developing allergy sensitization and asthma were 65% and 25%, respectively. Specific antigens of the storage mite and cockroach were only found in samples from the southern and tropical regions of China. Levels of mite allergens were generally higher in samples from bedding compared to samples from the living room, even for storage mites, whereas levels of cockroach antigens were higher in the living room samples.Conclusion HDM allergens are present in bedding dust samples from most Chinese households. Cities in southern and central China have relatively high levels of HDM major allergens compared to cities in northern and western China. Antigens of storage mites and cockroaches are not as common as HDM allergens.

粉尘螨变应原第2组分血清特异性IgE酶联免疫吸附测定法的建立及其检测效能的评价

目的建立粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)血清特异性IgE的酶联免疫吸附测定(ELISA)法,并评价其检测效能。方法利用重组表达的Der f 2作为包被抗原,分别建立检测Der f 2血清特异性IgE的间接ELISA法和亲和素-生物素复合(ABC)-ELISA法,采用正交试验筛选两种方法的最优检测条件。分别采用上述两种ELISA法检测Der f 2特异性IgE阳性标准血清,绘制两种ELISA法检测Der f 2特异性IgE的标准曲线;同时以Pharmacia Uni Cap系统检测结果为金标准,计算两种ELISA法检测46例哮喘患者血清Der f 2特异性IgE的结果符合率。结果间接ELISA法检测Der f 2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为10μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgE抗体稀释倍数为1∶1 000。ABC-ELISA法检测Der f 2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为15μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,生物素标记抗人IgE抗体稀释倍数为1∶1 000,HRP标记的链霉和素稀释倍数为1∶2 000。间接ELISA和ABC-ELISA法的灵敏度值分别为0. 72 U/ml和0. 69 U/ml。间接ELISA和ABC-ELISA检测哮喘患者的符合率分别为93. 5%和95. 7%。结论成功建立基于重组表达Der f 2的ELISA法,其对Der f 2特异性IgE具有较好的检测效能。

两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定

目的原核表达尘螨1类变应原（粉尘螨1类变应原仇叩和户尘螨1类变应原Derpl基因）的嵌合基因R8，并检测其生物活性。方法以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板，用Derel的特异性引物进行PCR扩增，产物经酶切后与载体pET28a（＋）连接，连接产物转入大肠埃希菌（E.coli）BL21感受态细胞，并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后纯化，十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS．PAGE）检测；纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清（IgE）的结合能力，同时以重组rDerfl和rDerP1蛋白作为对照。为检验嵌合蛋白R8的免疫原性，将75只BALB／c小鼠随机均分为5组，分别为PBS组（阴性对照组）、rDerf1组、rDerP1组、R8组和哮喘组（阳性对照组）。除PBS组外，其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射（0．1μg/μl）粉尘螨注射液100μ1，第21～27天每鼠每天雾化吸入0．5μg／ml粉尘螨注射液悬浊液，30min／d。rDerf1组、rDerP1组和R8组于第25～27天雾化前30min．分别腹腔注射100μg／ml的rDerf1、rDerP1和R8蛋白各200μl进行特异性免疫治疗，PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸人。所有小鼠于第27天雾化吸入后24h气管切开，用1mlPBS进行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（BALF），检测γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果SDS-PAGE结果显示，R8表达产物的蛋白相对分子质量（Mr）约为35000。EUSA检测结果显示，嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为（37．03±12．46）μg／ml，显著低于rDerf1[（80．44±15．50）μg／ml]和rDerP1[（90．79±10．38）μg／ml]（P〈0．01）。动物实验结果显示，R8组IFN-γ水平[（343．43±38．79）pg／ml]与rDerfl组[（322．98±30．36）pg／m1]和rDerP1组[（314．97±33．89）pg/ml]的相比，差异均无统计学意义（P〉0．05）；与PBS组[（393．93±50．68）pg/ml]和哮喘组[（208．44±46．11）pg／m1]相比，差异均有统计学意义（P〈0．01）。R8组IL4水平显著低于其他各组水平（P〈0．05或0．01）。结论表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8。

上海市区屋尘螨区系和季节消长的观察

在上海市区的居民家庭和旅店中,用吸尘器从床褥、枕头、沙发、毛衣和地板上采集屋尘样本。区系观察表明上海有4亚目9科21种螨,其中户尘螨为优势种,其次为舍赫尘螨、隐秘甘食螨、粉尘螨、埋内欧尘螨。户尘螨主要集聚于枕头、沙发、床褥和毛衣的样本中,隐秘甘食螨多见于地板上。螨种数以8月份最多(17种),冬季最少。全年的季节消长观察显示:屋尘螨活螨的单位面积密度高峰出现于5—6月间,最高达103只/m^2,而以1—2月间最低。死螨的密度以冬季为最高。屋尘螨密度的变化与大气的温度变化有关。

尘螨变应原的免疫印渍法分析

尽管粉尘螨浸液中的许多蛋白具有变应原性,但进一步用免疫印渍法分析,它们又分成若干能和哮喘患者的IgE结合的较小组分,这些组分是异质的并显示出不同的图谱。与皮肤挑刺试验、ELISA比较:免疫印渍法中IgE抗F_1和皮肤挑刺试验阳性、阳性符合率达91%,免疫印渍法和ELISA法测IgE结果在统计上显著相关(r=0.7029 p<0.01)。因此本文提出:具有小分子量的变应原组分可形成众多的分子量较大的变应原,其中F_1(MW1800 OD)是主要变应原组分。

舌下含服粉尘螨滴剂治疗螨过敏类变应性鼻炎患儿不同疗程的疗效

目的分析螨过敏类变应性鼻炎(AR)患儿行粉尘螨滴剂舌下含服不同疗程的疗效情况。方法回顾性分析2013年以来就诊于华中科技大学协和深圳医院(南山医院)耳鼻喉科的螨过敏AR患儿共120例,随访资料齐全且已完成4年疗程舌下含服免疫方法(SILT),治疗前、治疗期间间隔3个月开展随访就结束治疗后分别评估鼻炎症状评分(TNSS)、鼻炎用药评分(TRMS)、视觉模拟量表(VAS)及鼻结膜炎生活质量量表(RQLQ)评分以及不良反应情况。结果与治疗前相比,SLIT治疗1年结束时TNSS、TRMS、VAS评分、RQLQ评分均有显著改善(P<0.05);与SLIT 1年疗程相比,SLIT治疗2年结束时TNSS、TRMS、VAS、RQLQ评分均有显著改善(P<0.05)。与SLIT 2年疗程相比,SLIT治疗3年结束时VAS、RQLQ评分均有显著性改善(P<0.05)。与SLIT 3年疗程相比,SLIT治疗4年结束时TNSS、TRMS、VAS、RQLQ评分差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗1、2、3年及4年结束时,患儿的不良反应发生率对比差异无统计学意义(P>0.05),所有患儿均未出现严重不良反应。结论螨过敏AR患儿开展超过2年粉尘螨滴剂舌下含服疗效较1年更佳,3年疗程VAS及RQLQ评分改善较2年更明显,因此患儿至少需坚持2年治疗,3年是最佳疗程。

尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系构建及可溶性表达

目的建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系并诱导表达。方法以质粒pMD19-T-Der f 2为模板扩增目的基因Der f 2,克隆至pCold TF DNA载体,转化BL21细菌,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和West-ern blot鉴定表达产物。结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pCold TF-Der f 2。SDS-PAGE检测表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达,表达产物分子质量单位为69ku,Western blot检测该蛋白能被鼠抗Penta-His抗体识别。结论成功建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系,并实现其可溶性原核表达。

重组粉尘螨变应原第2组分的研究概况

尘螨是最常见的室内变应原来源之一，约80％以上尘螨过敏性疾病患者血清螨特异性IgE可与尘螨变应原第2组分结合。粉尘螨变应原第2组分Derf2为螨体的组织成分，被认为是诱导哮喘与变态反应性疾病的最重要变应原之一。近年来，变态反应性疾病的发病率呈现逐年增高的趋势，而重组变应原在过敏性疾病诊断和治疗中具有独特的优势和前景，故正日益成为此领域中研究的热点之一。该文就Derf2的生物学特征、重组变应原的制备、免疫学效果及其在特异性免疫诊治中的应用前景予以综述。

粉尘螨1类变应原T和B细胞表位t合基因的构建与表达

目的：构建粉尘螨1类变应原（Derf1）的T和B细胞表位嵌合基因原核表达载体。方法将Derf1包含的5个T细胞表位（T1～T5）和6个B细胞表位（B1～B6），以B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5连接方式直接合成表位嵌合基因，并分别命名为Derf1A和Derf1B。构建原核表达重组质粒pET-28a（＋）-Derf1A和pET-28a（＋）-Derf1B，双酶切及测序验证的阳性克隆转化到E.coliBL21（DE3）后诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物后进行纯化，并进行Westernblotting鉴定。ELISA法检测嵌合蛋白对粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合力。结果双酶切及测序结果表明，成功构建了原核表达重组质粒pET-28a（＋）-Derf1A和pET-28a（＋）-Derf1B；SDS-PAGE分析表明，Derf1A和Derf1B诱导并纯化成功，Westernblotting结果进一步证实纯化了Derf1A和Derf1B嵌合蛋白。与Derf1相比，Derf1A和Derf1B嵌合蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力显著降低（P均＜0.05），但Derf1A和Derf1B间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论成功表达了Derf1的T和B细胞表位嵌合蛋白，为粉尘螨过敏的特异性免疫治疗奠定了基础。

粉尘螨3类变应原的T细胞表位预测及鉴定

目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)的T细胞表位。方法运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T细胞抗原表位,并人工合成所预测的T细胞表位肽。采用改良MTT法,用预测表位肽刺激致敏鼠脾淋巴细胞进行脾淋巴细胞增殖试验;酶联免疫吸附试验检测脾细胞培养上清液中白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-4及IL-5水平。结果成功预测了Der f 3的5个T细胞表位肽,通过脾淋巴细胞增殖试验,其中3个表位肽序列可促进脾淋巴细胞增殖并刺激细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,抑制细胞因子IL-4和IL-5的分泌。其序列分别为37GDCPYQISLQSSSHFCGG54、98IYQHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123和164SELQRVDIDVVSREQCDQLYS184。结论初步鉴定了Der f 3变应原中3个T细胞表位序列,为后续过敏性哮喘的诊断和特异性免疫治疗奠定基础。

粉尘螨3类变应原的B细胞线性表位预测及鉴定

目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)中的B细胞线性表位。方法运用生物信息学技术,从抗原性、表面易接近性、柔韧性、亲水性、β转角等5个方面在线预测Der f3的B细胞线性抗原表位。同时,采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用,明确其中的强阳性表位肽序列。结果成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中,在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33KAKAGDCP40、86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、199DVANGGVDSCQGDSGGPVVD218和156QEGSYSLP1635个强阳性表位肽序列。结论成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列,为尘螨过敏性哮喘的诊断和治疗奠定基础。

重组粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达及纯化

目的表达并纯化粉尘螨2类变应原Der f 2蛋白,检测其变应原性。方法用1mmol/L的IPTG诱导含重组质粒pET30a-Der f2的大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE电泳检测并纯化目的蛋白,ELISA检测其与尘螨哮喘患者血清IgE的结合活性。结果 SDS-PAGE电泳检测重组质粒pET30a-Der f 2表达产物,其分子质量单位为15ku,与预期大小相符。ELISA检测纯化的Der f 2蛋白可与尘螨哮喘患者血清IgE反应。结论成功获得并纯化了Der f2重组蛋白,该蛋白具有变应原性,为进行尘螨过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗的动物实验奠定了物质基础。

粉尘螨变应原第6组分基因克隆及序列多态性分析

目的获得粉尘螨变应原第6组分(Der f 6)的编码基因并了解其序列多态性。方法根据GenBank(AF125187)公布的Der f 6的CDS区序列设计引物,使用PrimeSTAR?HS DNA进行PCR扩增,将目的基因片段与pMD19-T simple连接,进行序列测定和多态性分析。结果获得粉尘螨Der f 6编码基因,大小为839bp。对5个Der f 6克隆质粒测序并与参考序列GenBank No.AF 125187和GenBank No.EU085359比对,出现突变的cDNA序列合计36处,cDNA克隆中序列存在27处突变至少达到3个;推导的氨基酸序列有15处与上述27个位点一致。结论获得粉尘螨Der f 6编码基因并证明其序列具有多态性,为相关研究奠定了基础。