鼠源Desmin基因克隆表达及其生物信息学分析

【目的】构建鼠源III型中间丝蛋白Desmin真核/原核表达载体,明确鼠源Desmin蛋白生物学功能,为在体外及细胞内表达系统中鉴定Desmin互作蛋白及探索其作用网络提供理论依据。【方法】通过RT-PCR克隆Desmin基因,分别构建原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag,以IPTG对原核表达载体进行诱导表达,并通过ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对Desmin蛋白进行生物信息学分析。【结果】鼠源Desmin基因长1410 bp,选用pGEX-4T-1载体和pcDNA3.0载体分别成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag。原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag转化大肠杆菌后经IPTG诱导,成功表达出70 kD的融合蛋白Desmin-Flag;真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag转染BHK-21细胞,通过Western blotting在56 kD处检测到Flag标签,即Desmin蛋白能在真核细胞成功表达,且主要定位在细胞质。Desmin蛋白由470个氨基酸残基组成,分子量为54 kD,分子式为C2299H3722N688O755S13,理论等电点(pI)为5.21,属于不稳定蛋白;蛋白脂溶系数为79.94,平均亲水系数(GRAVY)为-0.721,推测为亲水性蛋白;无跨膜结构域和信号肽;其二级结构由α-螺旋(占67.59%)、无规则卷曲(占22.39%)、β-转角(占1.92%)和延伸链(占8.10%)构成。【结论】鼠源Desmin蛋白在原核表达体系中主要以包涵体形式进行表达,在真核细胞中表达主要定位于细胞质,呈骨架结构分布,其理化性质不稳定,属亲水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽。Desmin作为一种重要的III型中间丝蛋白,在神经肌肉组织信号转导及与相关蛋白发生相互作用方面发挥重要作用。

小鼠骨骼肌Desmin启动子的克隆及表达活性分析

为了研究在体细胞中小鼠Desmin基因启动子是否具有表达活性,试验根据NCBI中小鼠Desmin启动子的序列,利用生物软件Primer Premier 6.0设计序列上、下游引物,克隆小鼠基因组中Desmin启动子片段,将克隆到的Desmin启动子片段与pAcGFP1-N1载体中的CMV启动子进行置换以构建真核表达载体pAcGFP1-N1-Des,然后将pAcGFP1-N1-Des依次转染CHO-K1、COS-7、293GP和NIH-3T3等细胞后,观察绿色荧光蛋白表达活性。结果表明:克隆得到的Desmin基因上游启动子(841 bp)与NCBI序列(NT_039173.7)比对同源性为99.76%;克隆得到的启动子中含有CAAT-box、GC-box核心调控区以及MyoD等多种转录因子结合位点;所构建的pAcGFP1-N1-Des经转染COS-7、CHO-K1和Hela细胞后可观察到呈现表达活性的绿色荧光。说明克隆获得了在COS-7、CHO-K1以及Hela细胞中的具有表达活性的小鼠Desmin基因启动子。

克山病与Desmin基因突变的关系探讨

目的探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法采用临床流行病学方法调查,随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者,病区正常组和非病区正常组各30例的血样,提取基因组DNA,采用PCR扩增、酶切,电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变错义突变位点。结论Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。

DES基因突变致结蛋白相关肌病一例

1病例资料患者女性,25岁,因“反复晕厥3月余”于2022年3月4日入院。患者3个月前无明显诱因感头晕,无胸闷、心悸,随即出现意识丧失,当时无目击者,具体情况不详,约3~4 s后意识恢复,苏醒后仍感头晕,伴冷汗,无胸闷、心悸、口吐白沫等不适,间隔2~3 min后再次发生晕厥,晕厥前症状、晕厥时间、晕厥后症状与前次类似,遂于我院就诊,完善心电图示心室内传导阻滞,因自觉好转,患者拒绝进一步检查。本次入院当天患者无明显诱因再次出现晕厥,约5 s后意识恢复,苏醒后感头晕,伴冷汗,无胸闷、心悸、口吐白沫等不适,遂再次于我院就诊,心电图示二度Ⅱ型房室传导阻滞(图1),门诊拟“高度房室传导阻滞”收治我科。患者自起病以来,精神、食欲、睡眠尚可,近期体重无明显变化。既往史、个人史无特殊。家族史:父亲(图2家系中的先证者,Ⅱ-1)和大叔(Ⅱ-3)均有晕厥病史,心电图均表现为三度房室传导阻滞,并先后植入起搏器。患者父亲(先证者,Ⅱ-1)36岁时出现三度房室传导阻滞,3年后出现骨骼肌无力,曾行结蛋白(DES)基因检测,发现DES基因存在提示关注位点,其DES的c.1256C>T(编码区第1256号核苷酸由胞嘧啶变异为胸腺嘧啶)导致氨基酸改变p.P419L(第419号氨基酸由脯氨酸变异为亮氨酸),为错义突变(表1),诊断考虑症状可能为DES突变所致(经公共数据库查询,DES基因突变会导致常染色体显性遗传疾病扩张型心肌病1型、常染色体显性遗传/常染色体隐性遗传疾病肌原纤维肌病1型和常染色体显性遗传疾病神经源性Kaeser型肩胛腓骨肌综合征),因当时其他家族成员均无症状,且家属考虑检测费用昂贵,其他家族成员未行基因筛查;患者大叔(Ⅱ-3)39岁时出现三度房室传导阻滞,2年后逐渐出现骨骼肌无力,49岁死亡,未行基因检测。本例患者入院后查体:体温36.7℃,脉搏45次/min,血压116/70 mmHg。双肺呼吸音清,双肺未闻及干、湿啰音。

牛结蛋白基因启动子的克隆及功能的初步分析

旨在克隆牛结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行功能分析。本研究采用PCR法扩增牛结蛋白基因不同长度的启动子缺失序列,构建pGL3-desminpro双荧光素酶表达载体,使其转染牛骨胳肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,进行活性检测。同时转染牛MyoG和βα-actin基因启动子的表达载体,以比较结蛋白启动子和MyoG及α-actin启动子的表达活性。结果表明,牛结蛋白基因的132~2106 bp启动子都能不同程度的启动双荧光素酶报告基因在牛骨胳肌卫星细胞中的表达,且都具有肌肉特异性。300bp的结蛋白基因启动子活性最高,且高于牛MyoG和α-actin基因启动子的活性。从而筛选出300 bp的结蛋白基因启动子为活性较高且大小合适的肌肉特异性启动子,这为转基因肉牛的生产方面奠定了重要的基础。

人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠压力性尿失禁

目的探讨人脐带间充质干细胞(HUMSCs)移植治疗大鼠压力性尿失禁(SUI)的作用机制及有效性和可行性。方法建立SUI大鼠模型,模型大鼠分为HUMSCs治疗组8只(A组,大鼠尿道周围注射HUMSCs约1×107个细胞)和实验对照组8只(B组,相同部位注射等量生理盐水),另取6只正常大鼠作为正常对照组(C组)。建模后4周,将HUMSCs移植注射于大鼠尿道周围,在移植注射前1周及移植注射后6周分别测量所有大鼠最大膀胱容量(MBC)和漏尿点压力(LPP);行免疫组织化学检查,分析大鼠尿道括约肌中结蛋白、重链肌球蛋白(MHC)和蛋白基因产物9.5(PGP9.5)的表达。结果 HUMSCs治疗组大鼠MBC、LPP测量值均较移植治疗前明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);与实验对照组的MBC、LPP测量值相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组织化学检查显示HUMSCs治疗组大鼠尿道括约肌中结蛋白、MHC、PGP9.5含量均较实验对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HUMSCs移植治疗SUI大鼠有效、可行,HUMSCs通过修复损伤的大鼠尿道括约肌和周围神经来提高控尿功能。

1个结蛋白基因新突变致扩张型心肌病家系的临床特点及遗传分析

目的 对1个扩张型心肌病的家系进行遗传学分析,探讨其致病性基因变异位点,为遗传咨询提供数据支持。方法 收集该家系现存成员的临床资料和外周血,采用外周血DNA提取试剂盒提取白细胞基因组DNA,采用全外显子组二代测序技术筛选出与扩张型心肌病相关的可疑致病性变异,用Sanger测序对变异位点进行验证,结合家系共分离分析及多种生物信息学方法(如UniProt、PolyPhen-2和Mutation taster、ANTHEPROT、PyMOL等)综合验证和预测该变异的有害性,并根据ACMG指南对该变异位点进一步解读。结果 该扩张型心肌病家系符合常染色体显性遗传模式,患病成员均携带结蛋白基因(desmin,DES),是未曾报道过的一种杂合错义新突变DES c.140G>T(p.Ser47Ile)。生物信息学预测结果显示,该突变可改变蛋白质的二级结构,增加其疏水性并使其抗原性下降,还可使该位点原有的氢键和潜在的磷酸化位点丢失。根据ACMG指南可将该突变解读为可能致病的变异。结论 新发现的DES基因c.140G>T(p.Ser47Ile)变异可能是该常染色体显性遗传家系的致病原因,该家系患者出现临床表型的时间相对较早且预后不良,突变的检测有助于患者早期诊断与个性化的临床管理及治疗。

时钟基因BMAL1在运动性骨骼肌损伤恢复中的作用

目的:探讨时钟基因BMAL1在运动性骨骼肌损伤恢复中的作用。方法:208只8周龄SD大鼠随机分为对照组(C组,n=104)和运动组(E组,n=104)。E组于跑台进行90 min下坡跑,运动后于0 h,6 h,12 h,18 h,24 h,30 h,36 h,42 h,48 h,54 h,60 h,66 h,72 h各取C组、E组8只大鼠腓肠肌,通过实时荧光定量PCR实验检测骨骼肌核心时钟基因BMAL1表达量,应用余弦分析软件circacompare(R package)获取拟合余弦曲线参数,分析其节律性振荡的变化趋势;透射电镜观察骨骼肌肌纤维超微结构变化;免疫印迹法(Western blot)检测骨骼肌BMAL1、DESMIN表达;免疫荧光观测BMAL1与DESMIN的定位及含量变化。结果:C组BMAL1 mRNA在72 h内呈现3个完整近日节律周期;E组BMAL1 mRNA在0 h~24 h近日节律消失。与C组比较,E组在运动后0 h、6 h、12 h、18 h,BMAL1 mRNA含量显著升高(P<0.05),在运动后0 h、12 hBMAL1蛋白表达显著升高(P<0.05)、24 h至72 h恢复至无明显差异(P>0.05);在运动后0 h、12 h,DESMIN蛋白表达降低(P<0.05),24 h开始逐渐升高,48 h显著升高(P<0.01),至72 h恢复至无明显差异(P>0.05)。E组BMAL1与DESMIN在运动后0 h、12 h、24 h发生共定位,0 h~24 h共定位呈现先降低后升高的趋势,24 h的荧光强度达到最高值。结论:运动后时钟基因BMAL1可能与调控骨架蛋白DESMIN的协同作用增强,从而与促进肌纤维结构恢复有关。

desmin基因exon6A360P错义突变与慢型及潜在型克山病心肌损伤的关系

目的探讨desmin基因exon6A360P错义突变与克山病心肌损伤的关系及exon6A360P错义突变是否是慢型及潜在型克山病损伤的易感基因。方法在陕西省克山病病区黄陵县店头镇和非病区西安市长安区，采用单纯随机抽样的方法，抽取年龄相匹配的慢型和潜在型克山病患者（病例组）30例及病区（内对照组）和非病区对照（外对照组）各30例。采集外周血5ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，盐析法制备基因组DNA。采用PCR方法，用特异性的Bsp1286I内切酶对可能发生突变的exon6位点进行酶切。设内对照，在desmin基因exon4位点进行酶切，判定标准为在122bp和60bp处各出现1个条带。琼脂糖凝胶电泳分析desmin基因exon6A360P错义突变位点，判定标准为desmin基因exon6位点酶切后在184bp和66bp处各出现1个条带。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示，内对照desmin基因exon4在Bsp1286I酶切前，在182bp处仅出现1条条带；在酶切后，被切成2个片段，在122bp和60bp处各出现1个条带。慢型及潜在型克山病患者desmin基因exon6在Bsp1286I酶切前和酶切后．均在250bp处出现了1个条带：病区和非病区对照组desmin基因酶切后．也是在250bp处出现了1个条带。3组结果相同，desmin基因exon6没有被Bsp1286I酶切开，A360P没有发生错义突变。结论慢型和潜在型克山病患者未检出desmin基因exon6A360P错义突变位点，desmin基因exon6A360P错义突变不是克山病心肌损伤的易感基因。