基于OPG/RANKL/RANK信号通路探讨傣药肾叶山蚂蝗的抗骨质疏松作用

目的探讨傣药肾叶山蚂蝗对去卵巢骨质疏松大鼠模型的作用及其机制。方法60只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、仙灵骨葆组(0.24 g·kg^(-1))、肾叶山蚂蝗低(1.35 g·kg^(-1))、中(2.70 g·kg^(-1))和高剂量组(5.40 g·kg^(-1))。采用双侧卵巢切除术建立骨质疏松模型,药物干预14周后,检测血清中骨钙素(Bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing Proteins,BGP)、骨保护素(Ostoeprotegerin,OPG)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的含量,苏木精-伊红(HE)染色法观察骨组织中骨小梁的变化;实时荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠胫骨中OPG/RANKL/RANK信号通路相关基因的表达。另取破骨细胞前体细胞株RAW264.7,分为阴性对照组、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)组、仙灵骨葆组、肾叶山蚂蝗低、中、高剂量组。阴性对照组不加RANKL,其余各组使用50 ng·mL^(-1) RANKL诱导,药物组同时分别加入不同浓度的仙灵骨葆和肾叶山蚂蝗含药血清进行干预。10天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,观察破骨细胞分化情况,qPCR测定OPG/RANKL/RANK信号通路相关基因的表达。结果与假手术组比较,模型组血清中OPG含量显著降低(P<0.01),ALP和BGP显著升高(P<0.01),骨小梁显著减少,断裂,排列稀疏,骨小梁之间间距大,胫骨组织OPG mRNA表达显著减少(P<0.01),RANKL、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)、活化T-细胞核因子1(NFATc1)、组织蛋白酶K(CTK)和降钙素受体(CalcR)mRNA水平的表达升高(P<0.01),肾叶山蚂蝗干预后能显著改善以上指标。RAW264.7培养10天后,与阴性对照组比较,RANKL组破骨细胞明显增多,肾叶山蚂蝗能显著降低破骨细胞的数量,OPG/RANKL/RANK通路相关基因表达趋势和动物实验一致。结论肾叶山蚂蝗能有效改善去卵巢大鼠模型的骨质疏松,其作用机制可能是通过抑制破骨细胞增殖分化,调节OPG/RANKL/RANK信号通路来实现。

肾叶山蚂蝗醇提对大鼠慢性肾功能衰竭的防治作用

目的为探究肾叶山蚂蝗醇提液干预对慢性肾功能衰竭(CRF)模型小鼠的改善作用。通过腺嘌呤诱导复制大鼠慢性肾功能衰竭模型,探讨肾叶山蚂蝗防治CRF的药效及作用机制。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、右归丸组(3.6 g·kg^(-1))、醇提取物高剂量组(21.87 g生药·kg^(-1))、中剂量组(7.29 g生药·kg^(-1))、低剂量组(2.43 g生药·kg^(-1))。造模前5天进行预防性给药,第6天开始,模型组与各给药组大鼠上午给予1.0%腺嘌呤灌胃,下午进行药物治疗,持续15天。末次给药24 h后,采用折射法测定尿比重(SG);生化分析仪测定尿肌酐(Ucr)、24 h尿蛋白(PRO);细胞分析仪测定红细胞计数(RBC)、血小板数(Plt)、血红蛋白(HGB)、平均血小板体积(Mpv)、平均红细胞容积(Mcv)。酶联免疫吸附试剂盒测定尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)含量与尿α1-微球蛋白(α1-MG)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)表达。苏木精-伊红染色观察大鼠肾脏病理形态、免疫组化染色和Western blot分析水通道蛋白2(AQP2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、低氧诱导因子(HIF-1α)相关蛋白表达。结果与模型组相比,给药后对大鼠精神萎靡、反应迟缓,毛色发黄粗糙伴脱落等各项症状和肾脏组织病理形态都有明显改善。血常规指标RBC、HGB、Mpv、Mcv水平升高,Plt水平降低。24 h总尿量显著下降(P<0.05),低剂量组SG明显上升(P<0.05)。当URO=3.2μmol·L-1时,药物治疗后尿PRO可恢复阴性。肾功能损伤指标BUN、α1-MG、KIM-1水平明显降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001);给药组大鼠肾指数和Ccr水平明显改善(P<0.05,P<0.01)。同时相关AQP2、TGF-β1和HIF-1α蛋白表达均有所改善(P<0.01,P<0.001)。结论肾叶山蚂蝗醇提液可以改善慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织病理及各项指标,减轻肾损伤及肾纤维化程度,对于防治大鼠CRF具有积极作用。

HPLC法测定不同产地的肾叶山蚂蝗中6种异戊基查尔酮的含量

建立3种不同产地的肾叶山蚂蝗中主要活性成分含量测定的方法并测定其含量.以90%的甲醇作提取剂并采用高速匀浆法进行提取,选取HPLC法测定6种异戊基查尔酮的含量,采用Waters XTerra RP-18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm,3.5μm）,以甲醇-0.5%的乙酸溶液作流动相,流速为1.0 m L/min;检测波长为285 nm.研究结果表明,6种异戊基查尔酮对照品分别在0.50-250,0.50-250,0.40-220,0.40-200,0.40-200,和0.40-260μg/m L范围内呈良好线性关系,相关系数r在0.999 5-0.999 8之间,回收率分别为95.7%-102.4%、97.0%-104.2%、95.0%-101.2%、98.5%-103.4%、95.4%-103.8%和96.5%-103.3%,RSD在1.78%-2.68%（n=7）之间,最低检出限在40-50 ng/m L之间,3种不同产地的肾叶山蚂蝗中6种异戊基查尔酮的含量在1.21-4.56 mg/g之间.该方法所得结果准确可靠,回收率高,重现性好,检出限较低,可用于肾叶山蚂蝗中主要活性成分含量的测定.

傣药肾叶山蚂蝗对雄性大鼠性行为及性激素的影响

为了明确傣药肾叶山蚂蝗对雄性大鼠性行为及性激素的影响,本试验将50只雄性大鼠随机分为5个组:空白组(生理盐水)、中成药阳性对照组(龟鹿补肾片)、肾叶山蚂蝗水提低剂量组、高剂量组和肾叶山蚂蝗醇提组;各组分别连续灌胃28 d后观察大鼠性行为并检测其血清睾酮和雌二醇含量。结果显示,与空白组比较,肾叶山蚂蝗醇提组和水提高剂量组的大鼠性行为频次明显增加,血清睾酮含量升高,雌二醇含量降低,其中醇提组作用尤为明显(P<0.01)。结果表明肾叶山蚂蝗具有提高雄性大鼠性功能的作用,该作用可能与调节性激素有关。

HPLC法研究肾叶山蚂蝗清除DPPH自由基能力

建立了以HPLC法对傣药-肾叶山蚂蝗甲醇提取物清除二苯基苦基肼自由基(DPPH.)能力的方法,通过实验得出最佳的色谱条件:色谱柱为AgilentEclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5μm),流速为1.0 mL/min,检测波长517 nm,柱温箱温度为20℃,进样体积20.0μL,流动相为不同比例的甲醇和水的混合液。在此条件下测定了DPPH.的清除率为50%时抗氧化剂的质量浓度(IC50)值,肾叶山蚂蝗甲醇提取物的IC50为1.51 mg/mL。

基于BMP-2/Smads信号通路研究傣族药肾叶山蚂蝗对去卵巢大鼠骨质疏松的保护作用及机制

研究傣族药肾叶山蚂蝗对去卵巢大鼠骨质疏松的保护作用及其机制。通过复制去卵巢骨质疏松模型,探讨肾叶山蚂蝗治疗绝经后骨质疏松症(PMOP)的药效和作用机制。大鼠随机分为假手术组,模型组,仙灵骨葆组以及肾叶山蚂蝗低、中、高剂量组。除假手术组切除双侧卵巢周围脂肪组织外,其余各组均行双侧卵巢切除术。术后恢复性饲养2周,假手术组和模型组分别给予等体积的0.5%CMC-Na,仙灵骨葆组和肾叶山蚂蝗各剂量组分别给予仙灵骨葆和不同浓度的肾叶山蚂蝗醇提物,每天灌胃1次,连续14周。实验期间观察体质量变化,实验结束后取血检测血清中雌激素(E_(2))、1,25二羟基维生素D_(3)[1,25(OH)_(2)D_(3)]、钙(Ca)和磷(P)的含量;采用micro-CT技术对股骨骨微结构进行三维分析;实时定量PCR(RT-PCR)检测大鼠胫骨中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、核心结合蛋白因子2(Runx2)和成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)mRNA的表达;蛋白免疫印记法(Western blot)检测大鼠胫骨BMP-2、Runx2和OSX蛋白表达情况。结果显示,肾叶山蚂蝗能显著抑制大鼠体质量的增长,改善子宫外观形态,升高血清E_(2)、Ca、P和1,25(OH)_(2)D_(3)的含量,增加骨小梁的数量并能减少骨小梁断裂,改善骨微结构相关参数,同时能升高大鼠胫骨中BMP-2、Runx2和OSX mRNA和蛋白的表达。以上结果表明,肾叶山蚂蝗能显著改善去卵巢大鼠的骨质疏松,其作用机制可能与调控BMP-2/Smads信号通路相关。