青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。

DHAR与草莓AsA积累关系及DHAR RNAi遗传转化研究

【目的】确定草莓脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)酶活性与抗坏血酸(ASA)的关系,研究DHAR对AsA积累的调控作用,为筛选高AsA草莓品种育种提供理论基础。【方法】于不同时期测定草莓果实AsA含量和DHAR酶活性并进行相关性分析,构建DHAR基因RNAi植物表达载体,通过农杆菌介导法,将RNAi植物表达载体导入草莓中。【结果】草莓果实成熟过程中AsA含量呈现上升趋势,生长后期含量增幅最大。随着草莓果实的成熟,DHAR酶活性逐渐增大,在生长后期酶活性最高。构建了脱氢抗坏血酸酶基因(DHAR)的RNAi植物表达载体(Part27-IDHAR),并采用农杆菌介导法转入草莓,共获7株PCR阳性植株,初步说明目的基因已整合到草莓组织中。【结论】DHAR酶活性与AsA积累呈显著正相关,获得的转基因植株可为下一步研究提供植物材料。

棉花GhDHAR2基因克隆、功能序列分析及原核表达

通过RT-PCR方法从棉花纤维组织中克隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR2的cDNA,该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸的蛋白质。同源性序列对比分析显示,GhDHAR2蛋白具有较高的保守性,具有典型的功能结构域,包括GST-N家族和GST-C-DHAR家族的功能结构域;进化树分析显示GhDHAR2和拟南芥AtDHAR2在进化关系上较近。将GhDHAR2基因连接到原核表达载体pET-28a中,将重组载体pET28a-GhDHAR2转入到表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达出重组GhDHAR2蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示重组蛋白大小约为28 kD,诱导表达的重组蛋白具有较高的DHAR活性。首次克隆了棉花GhDHAR2基因,通过结构域分析其可能的作用,并成功进行蛋白体外表达及酶活性分析。

DHAR基因植物表达双元载体的构建及转化百合研究

将质粒pSB166中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303,构建了中间表达载体,将DHAR基因与pCSB定向连接,构建了DHAR基因植物表达载体pCSB-DHAR。进而以百合叶片为受体,通过根癌农杆菌介导的方法将DHAR基因转入百合,对转基因百合进行PCR检测,初步表明DHAR基因已整合到百合基因组中。

小麦DHAR基因的克隆及生物信息学分析

以电子克隆和RT-PCR克隆获得了1个小麦脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,并对其编码的蛋白质序列进行了生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列长1 187bp,编码263个氨基酸,蛋白质分子量为28 908.2Da,PI为6.84;具有GST-N家族和GST-C-DHAR结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族;该蛋白序列无信号肽,是亲水性蛋白,定位于细胞质叶绿体中,二级结构中以无规则卷曲(40.30%)和α螺旋(37.64%)为主,并含有少量的片层结构(17.11%);该蛋白序列与大麦、二穗短柄草、玉米、水稻、拟南芥的同源蛋白序列相似性较高,其中与大麦胞质DHAR(BAJ97007.1)蛋白进化距离最近。

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.

刺梨GGP和DHAR基因序列多态性及其与果实维生素C含量的关联分析

高含量的维生素C是刺梨果实的重要性状,挖掘与维生素C含量相关联的基因序列变异及单倍型对刺梨的品种改良具有指导意义。在21份野生刺梨资源中对GGP和DHAR基因进行PCR扩增和测序,分析基因序列多态性及其与果实维生素C含量的相关性。GGP基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为2035 bp的同源序列,其中包含22处变异位点,产生15种单倍型,在0.01显著性水平上,3个单核苷酸多态性(SNP)及Hap15与刺梨果实高含量维生素C相关;在0.05显著性水平上,3个SNP及Hap7与刺梨果实低含量维生素C相关;GGP基因单倍型存在网状进化。DHAR基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为1609 bp的同源序列,其中包含69处变异位点,产生9种单倍型,在0.05显著性水平上,8个SNP、9个InDel及Hap9与刺梨果实中低含量维生素C相关,1个SNP及单倍型Hap4~Hap6与刺梨果实中高含量维生素C相关;DHAR基因单倍型呈现扇形进化。GGP基因具有更高的单倍型多样性,DHAR基因具有更高的DNA多态性;GGP基因特异单倍型Hap15和DHAR基因特异单倍型Hap4共同存在于刺梨中时,可以使果实维生素C含量表现为高的状态;而GGP基因特异单倍型Hap7和DHAR基因单倍型Hap9同时存在于刺梨中时,可以使果实维生素C含量表现为低的状态。

ApDHAR基因的克隆与RT-qPCR 检测

在柞蚕体内,由其他昆虫脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)序列设计引物,克隆得到ApDHAR基因。并运用RT-qPCR方法,在体外注射维生素C条件下,测定该基因在4龄柞蚕幼虫体内表达量的变化,初步检验该基因的功能,以期为研究柞蚕维生素C代谢的分子机理提供帮助。

苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因cDNA片段的克隆及序列分析

以皇家嘎拉苹果叶片为材料提取总RNA,合成cDNA第一链后,先利用巢式PCR获得苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因中间片段,再利用3-′RACE方法进一步获得3′末端核酸序列,共得到840 bp包含完整3′末端的DHAR基因cDNA片段,其序列与烟草、水稻、番茄中DHAR基因序列的同源性均大于70%,证明所克隆到的核苷酸片段确为苹果DHAR基因cDNA片段。

罗汉果果实RNA的提取及SgDHAR基因的克隆与表达

针对罗汉果果实富含酚类、多糖、油脂和蛋白质等特点,从3种常用的RNA提取方法中优选出改良Trizol法,应用该法得到的RNA纯度高(OD260/280=2.01;OD260/230=2.02)、完整性好(RIN=9.50)、得率高(260μg·g-1)。以该法提取的RNA为模板,通过RACE和RT-PCR技术克隆罗汉果脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,其长度为1 252 bp,开放阅读框(ORF)为819 bp,命名为SgDHAR,GenBank登录号为KC907731,编码一条272个氨基酸的肽链,理论分子量为30.217 7 kD,等电点为8.76。该蛋白与GenBank中已登录的DHAR序列比对显示与黄瓜同源性最高(87%)。应用实时荧光定量PCR对SgDHAR在罗汉果不同组织及不同倍性中的表达模式分析发现,该基因主要在果实和茎中表达,其次是花,根中的表达量最低;在三倍体中的表达量为二倍体的6.83倍,推测该基因可能参与了三倍体无籽罗汉果的败育过程。

草莓DHAR基因密码子偏好性分析

以草莓为试材,运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析了草莓DHAR基因的密码子偏好性,并与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性及7种植物的DHAR基因密码子偏好性进行了比较,同时基于DHAR基因的密码子使用偏好性进行了系统聚类分析,以期在作物遗传改良中为草莓DHAR基因选择合适的遗传转化受体及进行基因优化提供依据。结果表明:草莓DHAR基因更适合导入苹果等双子叶植物中,若要提高草莓DHAR基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,还需进行密码子的优化。

高山松及其亲本种油松和云南松DHAR基因的功能分化

高山松(Pinus densata)是油松(P.tabulaeformis)与云南松(P.yunnanensis)自然杂交产生的同倍性杂种,分布于青藏高原东南缘,占据了油松和云南松两个亲本种都不能正常生长的高海拔地带。为了揭示高山松、油松和云南松脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因的组成和功能分化,分别从高山松、油松和云南松中克隆到2类DHAR基因(DHAR1与DHAR2)。组织表达模式分析表明,这6个基因在根、韧皮部、叶和芽中均有表达;通过系统发育分析发现,高山松在物种形成过程中保留了油松的DHAR1拷贝以及云南松的DHAR2拷贝;酶学性质分析则表明,高山松与油松DHAR1蛋白对底物具有相似的催化活性、催化效率、最适pH和热力学稳定性,但其催化活性比云南松DHAR1蛋白高约300倍。高山松DHAR2蛋白对底物的催化活性和热力学稳定性均高于油松DHAR2蛋白。高山松DHAR基因在生化功能上显示出优于或类似亲本DHAR,这种优势功能的选择与杂种独特的生态适应性可能有重要的相关性。

3种小麦DHAR蛋白高级结构建模与功能分析

为揭示小麦脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)的序列特征与其结构和功能的关系,利用DNAman软件比较了小麦3个DHAR基因(Ta DHAR1/2/3)和蛋白质序列特性,利用生物信息软件对蛋白质结构域、亚细胞定位、谷胱甘肽结合位点、N-末端结构域和C-末端结构域界面残基和二级结构进行了预测,并对蛋白质三级结构、表面电位和可及性的空间分布进行了模建和比较。结果表明,小麦Ta DHAR1和Ta DHAR2蛋白质序列长度一致,均定位于细胞质中,仅存在2个氨基酸残基差异,具有完全一致的保守结构域和三级结构;Ta DHAR3定位于线粒体中,与前2者在核酸与蛋白质序列上差异较大,但其保守域、谷胱甘肽结合位点氨基酸残基、假定的N-末端结构域界面残基和C末端结构域界面残基与前2者几乎完全一致,因此,3者可能执行相同的功能。模建的Ta DHAR1/2/3的三级结构均符合立体化学品质规则,其中Ta DHAR1/2的N端形成βαβαββα结构,Ta DHAR3的N端可能形成αββαβαβββ结构,3者在C端均形成β束结构,属于α+β球形蛋白。Ta DHAR1/2蛋白质的空间结构表面基本呈现负电分布,同时也分布着一些较小的正电集团,而Ta DHAR3蛋白质的空间结构表面整体上为均匀负电分布,基本不存在正电,3种小麦DHAR蛋白质表面的氨基酸残基可及性较强,内部可及性相对较弱。本研究有助于理解小麦DHAR蛋白的功能。

油菜DHAR蛋白家族序列特性与进化分析

脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)能还原被氧化的抗坏血酸分子,是细胞中维持抗坏血酸氧化还原平衡状态的重要酶之一。为获得油菜DHAR蛋白家族成员的序列特征和功能差异信息,本研究基于GenBank油菜基因组数据库,执行TBLASTN比对分析,获得了油菜DHAR蛋白家族成员,并比较了序列特性、进化关系、亚细胞定位、基因结构与染色体定位,预测了其蛋白质互作和表达谱信息。结果表明,共获得了11个油菜DHAR蛋白质家族成员,分为2大类,第一类共5个成员,包括DHAR1和DHAR2,均定位于细胞质,除序列XP_013693221外,均由213或214个氨基酸残基组成,在进化关系、基因结构和互作蛋白质的种类和数量方面非常接近,可能具有比较接近的酶活性和功能;第二类共6个成员,均由DHAR3成员组成,定位于叶绿体中,除XP_013665393外,其余成员均由255个或257个氨基酸残基组成,与前两者进化关系较远,并且与其互作的蛋白质种类和数量也与前两者存在显著不同,可能与前两者的酶活性和功能有较大差异。本研究为揭示油菜DHARs的分子特征与功能差异性提供了一些新的见解。

沙棘维生素C积累与相关酶活性关系研究

探讨沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)不同器官中抗坏血酸(As A)积累与相关代谢酶活性的关系。结果表明,As A在沙棘幼叶和果实中含量较高,在茎和花中含量较低。沙棘幼叶和果实中As A含量主要受L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性调节,抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)对As A的积累也有调节作用。

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸。通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性。结果表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径。

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。

玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究

通过电子克隆方法得到玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为ZmDHAR1。结果显示,ZmDHAR1基因全长723bp,开放阅读框642bp,编码214个氨基酸。ZmDHAR1基因与高粱、水稻及小麦等植物的脱氢抗坏血酸还原酶基因高度相似,其中与高粱的DHAR基因相似性为85%,与水稻的DHAR1基因相似性为83%。基因表达分析显示,ZmDHAR1基因在根以外的其他部位都可以检测到表达,而且ZmDHAR1基因可以在4℃低温、100μmol/L ABA、100mmol/L PEG、250mmol/L NaCl和机械损伤等多种逆境胁迫下均可应答表达。研究表明,ZmDHAR1基因可能在玉米抗逆境胁迫反应中发挥重要的作用。

UV-A辐射对大豆芽苗菜中抗坏血酸含量的影响

以黑暗培养为对照,以白光、红光、蓝光、黄光、UV-A和UV-B为处理,研究了不同光质对大豆芽苗菜生长和抗坏血酸含量的影响。结果表明:与对照相比,光照处理显著降低了大豆芽苗菜下胚轴的长度(白光除外),且显著提高了下胚轴和子叶中抗坏血酸含量。与其它光质处理相比,UV-A连续光照36 h后,下胚轴和子叶中抗坏血酸含量提高最显著。进一步着重研究了UV-A的调节机理,与对照相比,UV-A连续光照36 h后,大豆芽苗菜子叶中谷胱甘肽含量显著升高,下胚轴和子叶中DHAR、GR酶活性及其基因的相对表达量均显著提高。综上所述,光照有利于大豆芽苗菜中抗坏血酸含量的积累;UV-A可能是通过提高DHAR、GR酶活性及基因的表达量显著提高抗坏血酸的含量。

条锈菌侵染慢锈性小麦品种川麦107后的蛋白质组学分析

为了在基因和蛋白表达水平上研究小麦的慢条锈性机制,运用双向电泳技术分析了条锈菌侵染的2个小麦品种(川麦107和80-8)的对照和发病14 d叶片的差异表达蛋白,从2-D图谱上找到9个差异表达蛋白,其中点P5是在接种并发病的川麦107中新诱导出的一个差异蛋白质。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)获得6个蛋白质的肽指纹图谱(PMF),数据库搜索鉴定出2个蛋白质。这2个蛋白质是磷酸核酮糖激酶(Phosphoribulokinase,PRK)和脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate re-ductase,DHAR)。