Dhori病毒核蛋白抗原表位的筛选及鉴定

目的研究鉴定DHOV核蛋白(NP)的最小线性B细胞表位(BCEs),为DHOV的疫苗研制和预防奠定基础。方法本研究针对DHOV-GRT169毒株NP蛋白进行生物信息学分析,采用改良生物合成肽法鉴定其BCEs。首先将DHOV NP蛋白截短为4个片段并鉴定其抗原性,将阳性片段继续截短成相互重叠8个氨基酸的16肽,将16肽序列分别克隆至原核表达载体pXXGST-3中表达,兔抗融合蛋白NP蛋白多克隆抗体作为一抗,用Western blotting检测16肽的抗原性,将检测出的阳性16肽都截短成相互重叠7个氨基酸的8肽,用同样的方法诱导表达及检测。最后用生物信息学方法分析每个BCEs在NP蛋白三维结构中的位置。结果从NP蛋白中最终鉴定出9个BCEs,分别为Enp1(^(3)NPTPKR^(8))、Enp2(^(7)KRAEPGD^(13))、Enp3(^(83)YUFFFL^(88))、Enp4(^(111)NQTLTDE^(117))、Enp5(^(224)QSQKAMLK^(231))、Enp6(^(227)KAMLKQIF^(234))、Enp7(^(418)LNAEFEEY^(425))、Enp8(^(421)EFEEYSKL^(428))、Enp9(^(432)GTGAFYER^(439)),均位于NP蛋白表面。结论这些鉴定的表位将提高对DHOV表位分布和致病机制的认识,为DHOV多表位检测抗原的开发提供基础,也可为DHOV感染与免疫机制研究提供理论依据。

基于Dhori病毒GP蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究利用原核表达系统表达Dhori病毒(DHOV)糖蛋白(GP),以此为抗原建立间接ELISA检测方法。根据DHOV-GRT169毒株GP基因设计引物并扩增得到去除跨膜区与信号肽的基因片段,构建了重组表达质粒p ET-32a-GP,测序验证正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组GP蛋白。以DHOV阳性山羊血清为一抗,经Western-blot检测纯化蛋白后,以纯化的p ET-32a-GP为包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立检测DHOV血清抗体的间接ELISA检测方法,评价其重复性、敏感性和特异性。采用建立的间接ELISA检测方法检测新疆部分地区采集的不同动物血清样本中DHOV抗体。结果显示,pET-32a-GP原核表达质粒构建正确,GP蛋白大小约为66.8 ku,反应原性良好;ELISA条件优化确定的最佳包被浓度为4μg/m L、一抗稀释度为1∶1000、一抗孵育时间为30min、二抗稀释度为1∶3000、二抗孵育时间为30 min、TMB显色时间为4 min;重复性试验结果表明,批内与批间变异系数(CV)均<10%;敏感性试验表明,当阳性血清稀释度为1∶1400时具有良好的敏感性;特异性试验表明,建立的间接ELISA检测方法检测GTV、CCHFV和TAMV时呈阴性反应;随机选取343份采于新疆不同地区的动物血清进行ELISA检测,检出48份血清结果呈阳性,阳性检出率为13.99%。该检测方法的建立为DHOV的流行病学分析提供了基础,为进一步研究DHOV GP蛋白的生物学功能、检测试剂盒的开发以及疫苗的研制提供了理论依据。

Dhori病毒核蛋白基因的重组表达及其抗体制备

[目的]表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体peDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表达并亲和层析纯化rNP,以抗DHOV阳性羊血清检测其抗原性,免疫新西兰免制备抗血清,以ELISA法检测其效价。将pcDNA3.1-NP转染至Vero细胞,以间接免疫荧光法评估抗体的结合活性,WesternBlotting检测抗体与重组蛋白的特异性反应能力。[结果]pET-28a-NP和peDNA3.1-NP重组质粒构建正确,原核表达的rNP约为55.3kDa,并能被阳性羊血清识别,制备的抗体效价为1:409600,能特异性识别真核及原核表达产物。[结论]成功表达和纯化rNP,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物学特性及其检测试剂。