糖尿病大鼠早期视网膜小胶质细胞活化与神经节细胞损害的关系

目的 观察糖尿病早期视网膜小胶质细胞的活化特征与视网膜神经节细胞（RGC）损害的关系.方法 20只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,采用链脲佐菌霉素腹腔注射方法制作糖尿病动物模型,分为糖尿病1、3个月组及相应正常对照组,每组5只大鼠.对所有大鼠行上丘定位注射逆行标记RGC,分别用免疫组织化学法标记视网膜铺片、冰冻切片小胶质细胞和RC-C,共聚焦显微镜下观察小胶质细胞细胞形态及分布特征.结果 糖尿病组视网膜铺片小胶质细胞胞体增粗,形态不规则.与对照组相比,糖尿病3个月组RGC层发生吞噬的小胶质细胞密度显著增加（t=3.83,P〈0.01）.与对照组相比,糖尿病大鼠1、3月个组RGC层小胶质细胞平均密度均显著增加（t=2.71,4.22 P〈0.05） 糖尿病大鼠3个月组RGC层小胶质细胞平均密度较糖尿病1个月组显著增加（t=7.45,P〈0.0001）.糖尿病早期小胶质细胞与RGC数量之间存在相关关系（r=0.9,P〈0.05）.结论 糖尿病早期小胶质细胞活化与RGC损伤关系密切.

P38丝裂素活化蛋白激酶信号通路阻断对糖尿病鼠早期血视网膜屏障和视网膜节细胞的保护作用

目的 组织化学法检测视网膜上caspase-3和血管内皮生长因子（VEGF）的荧光表达.糖尿病鼠建模后2周,对实验组行玻璃体腔注射p38 MAPK抑制剂SB203580,注射后6周检测caspase-3和VEGF的荧光表达,caspase-3免疫荧光染色法计数RGC凋亡数量.采用SPSS 13.0应用软件进行统计分析.结果 正常对照组大鼠中,IgG染色局限于血管腔内,几乎没有渗漏的迹象.糖尿病鼠建模后8周,IgG渗漏明显增加.SB203580璃体腔注射6周后的糖尿病鼠IgG渗漏减少明显.荧光免疫组织化学及相对定量分析结果显示,SB203580玻璃体腔注射6周后的糖尿病鼠视网膜上VEGF荧光表达呈下降趋势,VEGF相对荧光量从糖尿病鼠8周时较正常对照组高2.9倍减少到仅高于正常对照组1.8倍,两者比较差异有统计学意义（t=5.203,P〈0.01）.caspase-3免疫荧光染色法RGC凋亡计数结果显示,SB203580玻璃体腔注射6周后,caspase-3-阳性节细胞凋亡数与未注射SB203580相比明显减少,两者差异有统计学意义（t=5.731,P〈0.01）.结论 p38 MAPK抑制剂SB203580能够减轻糖尿病早期血视网膜屏障的破坏和视网膜节细胞的调亡,提示p38 MAPK信号通路在糖尿病早期对DR的发展起着一定的作用.

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的 观察色素上皮衍生因子（PEDF）对糖尿病大鼠视网膜Muller细胞谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响.方法 将Sprague-Dawley大鼠分为模型组、模型对照组、PEDF干预组（干预组）、干预对照组,每组均为8只大鼠.模型组、干预组、干预对照组大鼠链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型.模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠,干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF10 μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液.采用免疫组织化学法和实时荧光聚合酶链反应（PCR）法检测视网膜GS和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达变化.将视网膜Muller细胞置于高糖环境下培养,实验干预组中加入100 ng/ml PEDF,空白对照组加入相同容积的培养液,24 h后通过蛋白质免疫印迹（Western blot）法和实时荧光PCR法检测PEDF对Mailer细胞GS和IL-1β表达的改变.流式细胞仪锚定蛋白-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶（Annexin V-FITC-PI）双染色法检测100ng/mlPEDF对高糖状态下Muller细胞凋亡的影响.结果 实时荧光PCR法从基因水平和免疫组织化学法从蛋白质水平检测均显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GS表达降低,而IL-1β的表达升高,实时荧光PCR法：GS t=4.23,P〈0.01 IL-1β：t=16.73,P〈0.01 免疫组织化学法：GS：t=5.13,P〈0.01 IL-1β：t=9.32,P〈0.01 干预组大鼠玻璃体腔注射PEDF 48 h后,IL-1β的表达下降,GS的表达升高,与干预对照组比较,实时荧光PCR法：GS：t=3.87,P〈0.01 IL-1β：t=3.61,P〈0.05 免疫组织化学法：GS：t=3.32,P〈0.05 IL-1β：t=2.63,P〈0.05.在高糖环境下,通过实时荧光PCR法和Western bot法检测均显示PEDF可以下调IL-1β的表达,而上调GS的表达,与空白对照组比较,实时荧光PCR法：GS：t=2.89,P〈0.05 IL-1β：t=3.37,P〈0.05 Western blot：GS：t=2.66,P〈0.05 IL-1β：t=3.23,P〈0.05.流式细胞仪检测结果显示,PEDF可以抑制高糖环境下Muller细胞的凋亡,实验组凋亡率与空白对照组凋亡率比较,差异有统计学意义（t=3.21,P〈0.05）.结论 对于糖尿病大鼠,PEDF可能通过下调视网膜Muller细胞中IL-1β的表达来上调GS的表达,从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡.

蛋白酶体抑制剂对糖尿病大鼠视网膜病变激活核转录因子-κB信号通路及视网膜神经节细胞凋亡的作用

目的 观察泛素蛋白酶体抑制剂对早期糖尿病性视网膜病变（DR）中激活核转录因子（NF-κB）和其抑制性信号蛋白IκB激酶的降解调控作用,及其对视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的影响.方法 健康成年雄性Wistar大鼠40只,用数字随机法随机分为正常对照组（A组）、DR安慰剂组（B组）、DR＋蛋白酶体抑制剂（MG132）低浓度干预组（C组）,DR＋MG132高浓度干预组（D组）,每组10只大鼠.给药后6、8周,检测每组大鼠体重、血糖,并制备视网膜石蜡切片,采用免疫组织化学法分析NF-κB及其抑制性信号蛋白IκB在大鼠视网膜中的表达.采用原位凋亡检测（TUNEL）法分析RGC的凋亡情况.结果 NF-κB在B组表达较A组明显增强,D组表达强度较B组减弱 IκB在B组表达较A组明显减少,D组表达强度较B组增强 RGC凋亡在B组的表达较A组明显增多,D组表达强度较B组减少 差异均有统计学意义（P〈0.01）.C组NF-κB和IKB的表达强度及RGC凋亡与B组相比,差异均无统计学意义（P〈0.05）.结论 泛素蛋白酶体抑制剂MG132通过抑制IKB泛素化降解,阻断NF-κB激活,抑制RGC的凋亡.

动态对比增强磁共振定量检测糖尿病视网膜病变血视网膜屏障渗漏的实验研究

目的 利用动态对比增强磁共振（DCE-MRI）定量检测实验性糖尿病视网膜病变（DR）血视网膜屏障（BRB）破坏程度,并探讨其可行性.方法 40只鼠龄3周的健康Sprague-Dawley（SD）大鼠随机平均分为实验组和正常对照组,实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素,注射48、72 h后检测大鼠空腹血糖及尿糖.血糖浓度在16.65 mmol/L、尿糖（＋＋＋）以上者视为建模成功,并按病程再分为糖尿病2、4、6、8个月,组每组各5只大鼠.正常对照组腹腔注射等体积缓冲液.并根据与实验组大鼠年龄匹配原则再平均分为4组.每组大鼠5只.分别在注射后2、4、6、8个月时利用DCE_MRl扫描眼球,计算BRB渗漏速度 戊巴比妥过量麻醉后摘除眼球观察视网膜组织形态.采用SPSS 12.0对数据进行统计学分析.结果 实验组大鼠成模率100%,正常对照组、糖尿病2、4个月组大鼠BRB未见明显渗漏,糖尿病6、8个月组大鼠BRB渗漏速度分别为（0.1399±0.0065）、（0.1816±0.2756）mm3/min,两者之间差异有统计学意义（Z=-2.121,P〈0.05）.实验组大鼠病程4个月时出现明显视网膜组织水肿,细胞排列紊乱,随病程延长逐渐加重,出现血管扩张,出血.结论 DCE-MRI能够较精确地检测实验性DR的BRB渗漏速度,定量化评价BRB的破坏程度.

糖尿病早期大鼠视网膜血管凋亡相关基因的表达

目的 使用基因芯片技术分析糖尿病早期大鼠视网膜血管凋亡相关基因表达概况。方法 腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备糖尿病大鼠模型。在血糖升高后的第6周分别处死正常组大鼠和糖尿病组大鼠各10只，提取20只眼的视网膜血管，一步法提取总RNA。使用（α-32P）脱氧腺苷酸（dATP）标记样品制作探针，与含有1176个基因的尼龙膜芯片进行杂交。使用计算机软件对所获结果进行相关分析。选择3个差异表达的基因进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证。结果 糖尿病大鼠第6周，136个基因具有差异表达，占检测基因总数的11.5％。其中，表现为上调的基因90个，占7.6％；表现为下调的基因46个，占3.9％。差异表达涉及多种功能的多个基因。与凋亡信号传导通路相关的72个基因中，有15个出现了表达的差异。表达上调的基因包括肿瘤坏死因子（TNF）家族中Fas相关的死亡域（FADD）、TNF受体家族成员12 （TNFRSF12）、TNF受体家族成员9 （TNFRSF9）和TRAIL；Bcl-2家族的bcl-2,bcl-w,bax和 bak1以及Akt等；表达下调的基因有Fas相关因子（FAF1）。结论 糖尿病早期大鼠视网膜血管基因表达发生了复杂的变化，特别是多个凋亡相关通路的基因在糖尿病早期就发生改变，而且多数处在通路上游。提示糖尿病视网膜病变的发生涉及多条凋亡信号传导通路，分子生物化学水平上的变化还仅仅局限在凋亡的诱导期。

αA-晶体蛋白在2型糖尿病大鼠神经视网膜的异常表达

目的 用蛋白质组学方法观察αA-晶体蛋白在早期2型糖尿病大鼠神经视网膜的异常表达.方法 28只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组.每组14只.糖尿病组大鼠采用高脂饮食饲养联合小剂量链脲佐菌素（STZ）注射诱导2型糖尿病模型（T2DM）,以随机血糖持续高于16.7 mmol/L为模型建立成功标准.对照组用常规饲料喂养.腹腔注射相同剂量枸橼酸钠缓冲液.成模56 d后断颈处死所有大鼠,剥离留存神经视网膜组织.从对照组和糖尿病组各取3只大鼠的神经视网膜组织,提取总蛋白,用二维凝胶电泳（2-DE）方法分别进行分离.应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）和肽质量指纹图谱（PMF）技术对部分差异表达蛋白进行鉴定,并用蛋白免疫印迹（Western blot）和间接免疫荧光（IMF）方法对在糖尿病组表达上调的αA-晶体蛋白进行验证.结果 平均每块凝胶检测到的蛋白斑点,对照组为（3122±37）,糖尿病组为（2702±21）个.二者比较,表达水平差异有统计学意义的斑点约150个（t值均〉2.57,P值均〈0.05）.在糖尿病组表达上调68个,表达下调82个.质谱分析和数据库检索鉴定出20个差异表达蛋白斑点.其中二维凝胶中2369和1048斑点在糖尿病组呈现高表达.经质谱PMF鉴定为αA-晶体蛋白.Western blot检测结果显示,αA-晶体蛋白在糖尿病组大鼠神经视网膜表达明显增高.IMF结果显示αA-晶体蛋白在糖尿病组高表达,阳性表达主要位于视网膜的内外核层,在细胞的核周细胞浆区域有强荧光聚集.结论 αA-晶体蛋白在早期2型糖尿病大鼠神经视网膜表达增高.