基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73(GP73)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法:利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,造成GP73基因蛋白读码框移码,使其功能缺失,针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠(GP73-/-小鼠)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73 mRNA表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清GP73蛋白水平。结果:与野生型(WT)小鼠相比,GP73-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73 mRNA及蛋白表达水平降低,血清GP73蛋白水平降低(均P<0.05)。结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。

血清GP73、HMGB1、FLP1、sST2与慢性乙型病毒性肝炎患者 HBV-DNA载量、肝功能及肝纤维化标志物的相关性分析

目的 研究血清高尔基体蛋白73(GP73)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、纤维蛋白原样蛋白1(FLP1)、可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)与慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV-DNA)载量、肝功能指标及肝纤维化标志物的相关性。方法 选择滨州市中医医院2021年2月至2022年2月收治的166例CHB患者作为研究对象。测定所有患者的HBV-DNA载量,并根据HBV-DNA载量的差异分为低载量组、中载量组、高载量组。另选取同期健康体检人员60例作为健康对照组。检测并比较各组肝功能指标水平、肝纤维化标志物水平,以及血清GP73、HMGB1、FLP1、sST2水平。以Spearman/Pearson相关分析血清GP73、HMGB1、FLP1、sST2与HBV-DNA载量、肝功能指标及肝纤维化标志物的相关性。结果 低载量组76例,中载量组50例,高载量组40例。低载量组、中载量组、高载量组血清GP73、HMGB1及sST2水平均高于健康对照组(P<0.05);且随着HBV-DNA载量的增加,GP73、HMGB1及sST2水平升高(P<0.05)。低载量组、中载量组、高载量组血清FLP1水平均低于健康对照组(P<0.05);且随着HBV-DNA载量的增加,FLP1水平下降(P<0.05)。中载量组、高载量组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及γ-谷氨酰转移酶(GGT)水平均高于低载量组(P<0.05),且高载量组ALT、AST及GGT水平高于中载量组(P<0.05)。中载量组、高载量组透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)及Ⅳ型胶原(CⅣ)水平均高于低载量组(P<0.05),且高载量组HA、LN及CⅣ水平均高于中载量组(P<0.05)。血清GP73、HMGB1、sST2与CHB患者HBV-DNA载量、ALT、AST、GGT、HA、LN、CⅣ水平均呈正相关(r>0,P<0.05),而血清FLP1与CHB患者HBV-DNA载量、ALT、AST、GGT、HA、LN、CⅣ水平呈负相关(r<0,P<0.05)。结论 血清GP73、HMGB1、FLP1、sST2水平可有效反映CHB患者的HBV-DNA载量、肝功能和肝纤维化情况。

腺苷诱导耗竭型CD8^(+)T细胞影响肾癌细胞迁移及凋亡

目的探索腺苷是否诱导耗竭型T细胞生成以及对肾透明细胞癌细胞迁移和凋亡的影响。方法流式细胞术检测肾透明细胞癌及癌旁组织中CD8^(+)T细胞及耗竭表型分子3(TIM-3)的表达。生物信息学分析肾透明细胞癌及癌旁组织中基因表达差异,寻找影响T细胞耗竭基因。利用shRNA技术构建稳定敲除该基因的肾透明细胞癌786-O细胞株,检测细胞的迁移、凋亡等生物学行为。制备不同肿瘤条件培养基,培养CD8^(+)T细胞,研究敲除基因后的肾透明细胞癌细胞对耗竭型T细胞的影响。结果肾透明细胞癌与癌旁组织相比高表达CD8^(+)T细胞及TIM-3。生物信息学分析发现腺苷合成限速酶NT5E(CD73)在肾透明细胞癌中的表达高于癌旁组织。检测临床标本发现肾透明细胞癌组织中腺苷及CD73的表达高于癌旁组织。与对照组比较,敲除NT5E组的786-O细胞迁移能力下降及凋亡增加。敲除NT5E的肿瘤条件培养基培养的CD8^(+)T细胞中程序性死亡蛋白1表达减少,抑制T细胞增殖能力下降。结论肾透明细胞癌组织存在耗竭型CD8^(+)T细胞、腺苷及CD73的高表达。敲除NT5E的肾透明细胞癌786-O细胞迁移能力下降、凋亡增加。敲除NT5E可减少腺苷合成,减少耗竭型T细胞的生成。

肝细胞癌组织中高尔基体糖蛋白73和分泌型聚集素的表达及其相关性分析

背景与目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种具有高度侵袭、转移性的常见恶性肿瘤,预后极差。因此,研究肝癌侵袭的机制,寻找有效的干预靶点显得尤为重要。一些研究提示分泌型聚集素(secreted Clusterin,sCLU)和高尔基体糖蛋白73(Golgi glycoprotein 73,GP73)在肿瘤发生、发展及侵袭、转移过程中起重要作用,且两者具有结构和功能上的相似性。本研究旨在探讨GP73和sCLU在HCC中的表达及其与临床病理特征和预后之间的关系。方法:收集新疆医科大学第一附属医院75例HCC患者癌组织及癌旁正常肝组织标本,采用免疫组化(EnVision二步法)检测HCC组织中GP73、sCLU的表达水平;并与癌旁正常肝组织相比较;Spearman等级相关分析GP73和sCLU在肝癌中表达的关系;研究GP73和sCLU表达水平与HCC临床病理特征及预后的关系。结果:GP73和sCLU在HCC中阳性表达率分别为72%和88%,癌旁正常肝组织的阳性表达率均为4%。GP73在HCC和正常肝组织中阳性表达差异有统计学意义(χ2=73.60,P<0.05)。sCLU在HCC和正常肝组织中阳性表达差异有统计学意义(χ2=207.94,P<0.05);Spearman等级相关分析提示,HCC组织中,GP73和sCLU蛋白表达呈正相关(r=0.405,P<0.05);GP73和sCLU在HCC中表达水平与肿瘤的Edmondson病理分级、TNM分期及血管侵犯相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、HBsAg、合并肝硬化、AFP值、门静脉癌栓、肿瘤数目无相关性(P>0.05);GP73表达与患者生存期有关,而sCLU表达与患者生存期无关。结论:GP73和sCLU在肝癌中有较高的阳性率,且GP73和sCLU表达呈正相关,GP73和sCLU可能与HCC的侵袭性等生物行为密切相关,检测其表达将有助于评价患者预后。

SDQ-73型深孔取样装置在松软高突煤层中的适用性研究

煤层瓦斯含量井下直接测定结果的准确性很大程度上取决于所取煤样的质量。针对松软高突煤层中取样问题的现状,展开了SDQ-73型深孔取样装置在松软高突煤层的适用性研究。通过在首山一矿二1煤层12050、12061工作面的井下试验,分别完成了SDQ-73取样适用性试验及孔口接粉取样试验,并对两种取样方法的测试结果进行对比分析,得出该深孔快速取样装置可实现在松软高突煤层中的深孔、定点、快速取样,且取样质量明显高于传统的孔口接粉取样,完全符合GB/T23250《煤层瓦斯含量井下直接测定方法》的取样要求。

G4-73型离心风机叶片翼型失速特性的数值研究

由于电站常用的G4-73型离心风机在气流掠过翼型时流速较低,雷诺数与航空翼型的差异较大,因此有必要对G4-73型离心风机翼型失速性能进行研究。对翼型附近网格采用局部加密,运用FLUENT软件对不同冲角下气流的流动情况进行了数值模拟,发现风机叶片翼型失速发生在非工作面。通过分析冲角与分离点位置的关系,以及由失速区域的流动情况得出:为保证风机安全运行,冲角应小于-20°;大冲角的情况下,处于翼型吸力面在X方向上相对翼型总弦长C的位置X/C=0.5处的漩涡最强烈,此漩涡将危及风机的安全运行。

p73基因在核型正常的急性髓细胞白血病中的表达与临床相关性的研究

目的:检测p73在核型正常的急性髓细胞白血病(cytogenetically normal acute myeloid leukemia,CN-AML)中的表达情况,探讨p73与CN-AML病情进展的关系及临床意义。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测68例CN-AML患者的骨髓单个核细胞中p73表达,根据核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin 1,NPM1)突变(NPM1 mutation,NPM1mt)或FMS样的酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)内部串联重复序列(FLT3 internal tandem duplication,FLT3ITD)将CN-AML患者分为3个不同的危险组:低危组(NPM1mt/no FLT3ITD内部串联重复),高危组(FLT3ITD),中危组(排除NPM1mt/no FLT3ITD和FLT3ITD的病例),并进行相关分析。对患者化疗的效果应用完全缓解(complete remission,CR)率进行评估。结果:68例CN-AML有29.4%患者p73过度表达,p73过度表达与CR率呈负相关。p73过度表达的CN-AML患者在低危组有更好的临床预后,有33.3%的患者获得CR;相反,p73过度表达者在高危组有更差的临床预后,均未获得CR。结论:p73过度表达可能是预测CR率的负性指标。p73过度表达与根据NPM1mt和FLT3ITD进行CN-AML危险分组相一致,可能对CN-AML的危险分组有意义。

G4—73型通风机应用性能缺陷与改造

投入运行不久的G4—73—11№25D主要通风机,发现其性能有重大缺陷,实际性能只有理论性能的37％～25％,严重制约着矿井生产发展,被迫进行一系列改造实践。其中,改造风机进风口衔接方式,性能提高8％～10％;更换配套电机,提高转速,性能提高20％左右。

慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者血清高尔基体蛋白73、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白水平及其临床意义

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)和乙型肝炎肝硬化患者血清高尔基体蛋白73(GP73)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白(LN)水平及其临床意义。方法 选取CHB患者30例(CHB组),乙型肝炎肝硬化患者36例(肝硬化组),以及健康体检者31例(对照组)。比较3组血清GP73、PCⅢ、Ⅳ型胶原、LN水平,分析CHB组及肝硬化组患者GP73水平与PCⅢ、Ⅳ型胶原、LN水平的相关性。结果 CHB组与肝硬化组患者GP73、PCⅢ、Ⅳ型胶原、LN水平均高于对照组,肝硬化组患者GP73、Ⅳ型胶原、LN水平均高于CHB组(均P<0.05)。CHB组患者血清GP73水平与PCⅢ及Ⅳ型胶原水平呈正相关,肝硬化组患者血清GP73水平与Ⅳ型胶原水平呈正相关(均P<0.05)。结论 GP73、Ⅳ型胶原、LN可能与CHB和乙型肝炎肝硬化的发生有关,GP73联合PCⅢ或Ⅳ型胶原或有助于提高其对CHB和乙型肝炎肝硬化的诊断效能。

2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者GP73水平的检测及临床意义

目的探讨血清高尔基体蛋白73(GP73)作为判断2型糖尿病(T2DM)是否合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)的临床应用价值。方法选取NAFLD患者122例,初治T2DM患者30例,T2DM合并NAFLD患者41例及健康体检者33例,采用酶联免疫吸附法定量检测患者血清中GP73水平,生化分析仪检测各肝功能指标,应用肝脏瞬时弹性检测仪检测其受控衰减参数(CAP)和E值,并分析血清GP73含量与上述指标的关系,ROC曲线分析GP73诊断NAFLD的效能。结果与单纯T2DM组(38.13±28.50)ng/ml及健康对照组(46.22±19.01)ng/ml相比,NAFLD患者组(76.19±41.38)ng/ml及T2DM合并NAFLD患者组(73.36±42.00)ng/ml血清GP73水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。以健康体检组及T2DM组为对照,GP73诊断NAFLD的ROC曲线下面积为0.792(95%CI:0.733~0.843,P<0.0001),以59.22ng/ml作为cut-off值,GP73诊断NAFLD的特异性和敏感性分别为82.54%为69.94%。血清GP73与ALT、AST、GGT、CAP、E值均呈正相关(r分别为0.221,0.152,0.232,0.214,0.285)。结论GP73可作为T2DM是否合并NAFLD及其发生肝细胞脂肪变与肝纤维化的潜在指标。

K4—73型离心通风机在两淮煤矿使用及布置特点

K4—73型系列离心式通风机,№25F、28F、32F、38F,可满足年产600万t矿井通风用.现厂方已生产№28F、32F两种规格风机,№38F风机已通过了设计方案,可以进行样机试制.一、该系列通风机结构的主要特点双吸进风,双支承结构,主轴采用实心长轴,为双轴伸,收敛式大偏进风口.调心滑动轴承传动,采用独立的压力稀油润滑系统,以保证风机安全运转及延长使用寿命。

5型腺病毒E1A基因通过调控GP73的表达抑制肝癌细胞增殖的初步研究

目的:研究5型腺病毒(Ad5)E1A基因通过调控高尔基蛋白73(GP73)的表达水平,抑制肝癌细胞HepG2的增殖。方法:以腺病毒为模板、pcDNA-flag-Vector为载体,构建真核表达载体pcDNA3-Flag-Ad5E1A;免疫印迹实验鉴定重组蛋白Ad5E1A的表达;免疫印迹实验验证Ad5E1A对GP73表达水平的影响;将Ad5E1A基因转染HepG2细胞,用CCK-8试剂盒检测HepG2细胞的增殖情况。结果:免疫印迹实验结果证实,真核表达载体pcDNA3-Flag-Ad5E1A在HEK293细胞中得到表达;Ad5E1A可明显抑制GP73的表达。酶标仪检测发现,与转染Flag-GP73组相比,Ad5E1A组的抑制率为17.5%,差异无统计学意义(P>0.05);而与转染Flag-GP73组比,共转Ad5E1A和GP73组的抑制率为37.8%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ad5E1A基因通过调控GP73的表达抑制了肝癌细胞HepG2的增殖。为研究肝癌发生机制,开发新型治疗方案提供了实验基础。

G4-73-11型锅炉送风机轴承箱油封的改造

介绍G4-73-11型锅炉送风机轴承箱油封的改造过程,提出将甩油盘用于轴承箱润滑油的密封,收到较好效果。

巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的构建并鉴定巨噬细胞条件性高尔基体蛋白73(golgi protein 73,GP73)基因敲除小鼠,为进一步研究GP73调控巨噬细胞功能影响肿瘤性疾病的发生发展提供动物模型。方法基于Cre/LoxP重组系统构建GP73^(flox/+)小鼠,通过GP73^(flox/+)小鼠雌雄自交得到GP73flox/flox小鼠。将GP73flox/flox小鼠与Lyz2⁃Cre+小鼠杂交,得到GP73flox/+Lyz2⁃Cre+小鼠,再将其与GP73flox/flox小鼠杂交,最终得到基因型为GP73flox/floxLyz2⁃Cre+的巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠(MKO小鼠);以GP73flox/floxLyz2⁃Cre-小鼠作为对照组小鼠(GP73^(fl/fl)小鼠)。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠flox及Cre基因型。采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)分别从mRNA水平和蛋白水平验证小鼠巨噬细胞GP73敲除效果及组织特异性。计算小鼠各组织质量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况,并检测小鼠血生化指标。结果通过基因鉴定、mRNA水平及蛋白水平证实巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠构建成功。qPCR检测显示,与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow⁃derived macrophages,BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM)中GP73 mRNA水平均降低(P<0.0001);Western blot检测结果显示,GP73蛋白在MKO小鼠BMDMs和PM中的表达水平均较GP73^(fl/fl)小鼠明显降低,但在肝脏、肾脏及胸腺组织中GP73蛋白表达水平无显著差异。与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠心、肝、脾、肺、肾、棕色脂肪及白色脂肪组织重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。血生化检测结果显示,MKO小鼠与GP73^(fl/fl)小鼠的各项血生化指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠模型,为深入研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中的作用和机制提供良好的动物模型。

HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清GP73、suPAR和AT-Ⅲ水平变化及其临床意义探讨

目的探讨乙型肝炎病毒相关性慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者血清高尔基体蛋白73(GP73)、可溶性人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)和抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)水平变化及其临床意义。方法2019年11月~2022年10月我院收治的HBV-ACLF患者81例(早期29例,中期28例,晚期24例)和慢性乙型肝炎(CHB)患者65例,采用ELISA法检测血清GP73、suPAR和AT-Ⅲ水平。应用受试者工作特征曲线(ROC)评估各指标评估疾病预后的价值。结果HBV-ACLF患者血清GP73和suPAR水平分别为(227.4±48.4)ng/mL和(8.3±2.3)ng/mL,显著高于CHB患者【分别为(126.6±31.6)ng/mL和(5.1±1.6)ng/mL,P<0.05】,而血清AT-Ⅲ水平为(48.2±12.9)%,显著低于CHB患者【(76.6±18.7)%,P<0.05】;晚期HBV-ACLF患者血清GP73和suPAR水平分别为(265.6±27.1)ng/mL和(9.4±1.2)n g/mL,显著高于中期患者【分别为(231.7±29.5)ng/mL和(8.4±1.4)ng/mL,P<0.05】或早期患者【分别为(191.6±33.5)ng/mL和(7.3±1.6)ng/mL,P<0.05】,而血清AT-Ⅲ水平为(36.8±9.1)%,显著低于中期患者【(47.1±10.9)%,P<0.05】或早期患者【58.7±11.3)%,P<0.05】;在治疗3个月末,本组ACLF患者生存59例(72.8%),死亡22例(27.2%);死亡组血清GP73和suPAR水平分别为(270.4±38.3)ng/mL和(9.9±6.2)ng/mL,显著高于生存组【分别为(210.9±41.5)ng/mL和(8.0±1.5)ng/mL,P<0.05】,而血清AT-Ⅲ水平为(35.4±9.1)%,显著低于生存组【(51.1±10.6)%,P<0.05】;联合检测HBV-ACLF患者血清GP73、suPAR和AT-Ⅲ水平预测短期死亡的AUC为0.846,显著优于三项指标单独评估(其AUC分别为0.703、0.710和0.744,P<0.05),其灵敏度、特异度和准确度分别为81.8%、81.4%和81.5%。结论监测HBV-ACLF患者血清GP73、suPAR和AT-Ⅲ水平可能有助于评估预后,值得进一步研究。

YZ-73型液动冲击器

YZ-73型阀式正作用液动冲击器是为满足对金、煤等某些矿种勘探的需要而设计的。本文除介绍其技术性能、结构特点外，还着重分析了特性曲线及冲击器对泥浆的适应性及寿命试验等情况。