二去水卫矛醇对肺癌NCI-H460细胞DNA拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用

目的评价二去水卫矛醇(dianhydrogalactitol,DAG)在肺癌NCI-H460细胞上的抗肿瘤作用,探讨其抗肿瘤作用机制。方法采用CCK-8法、细胞克隆形成实验,评价DAG对NCI-H460细胞的增殖抑制作用。显微拍照观察细胞形态改变;Hoechst 33342检测细胞核染色质的变化。Real time PCR法检测拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)mRNA的表达水平。Western blot法检测TopoⅡ蛋白表达水平。另外,应用计算机模拟分子对接技术来预测DAG与TopoⅡ的相互作用。结果 CCK-8法检测结果显示,DAG对NCI-H460细胞的体外抗肿瘤活性明显。细胞克隆形成实验结果表明,DAG能持续抑制肿瘤细胞的增殖。Hoechst 33342检测细胞凋亡发现细胞核染色质发生明显改变。Real time PCR和Western blot检测结果显示TopoⅡ mRNA和蛋白表达量降低。计算机模拟分子对接显示DAG与TopoⅡ有相互结合作用。结论DAG能明显抑制NCI-H460细胞的增值,作用机制研究表明DAG能降低TopoⅡ mRNA和蛋白水平,并与TopoⅡ结合,最终可能导致DNA双链断裂,引起细胞死亡。

气相色谱法测定注射用去水卫矛醇的含量及有关物质

目的:建立注射用卫矛醇含量及有关物质的气相色谱法。方法:采用Agilent DB-1(30 m×0.53 mm,1.5μm);程序升温:起始温度为100℃,维持3 min,以10℃·min^(-1)升至200℃,维持5 min;进样口温度为250℃,检测器F1D温度为250℃;载气为氮气,流速为5 ml·min^(-1)。结果:去水卫矛醇与其相邻杂质峰能完全分离,去水卫矛醇在0.010 05～1.005 mg·ml^(-1)浓度范围内线性关系良好(r=0.999 1),平均回收率为101.1%(RSD=1.12%,n=9)。结论:本方法操作简单,精密度好,结果准确可靠,可用于该制剂的质量控制。

二乙酰二脱水卫矛醇(DADAD)的稳定性研究

目的 将临床多年使用的抗癌新药卫康醇 (DAD)的前体药物 DADAD进行稳定性研究 ,预测贮存期。方法 将 DADAD置于强光、高湿、高温条件下进行影响因素的测定、室温 3年留样观察试验和“简便加速试验法”的研究。结果 各项指标基本保持不变。结论 3年留样试验结果表示其贮存期可定为 3年 ;在规定的强光、高温、高湿条件下 ,显示出其不敏感的特性 ;当其采用“简便加速试验法”,经 85℃和 6 0℃恒温的简便加速试验 ,用 Q1 0 法回归处理实验数据 ,求得室温 (2 5℃ )贮存期为 2 2年 ,显示出其较稳定 。

去水卫矛醇对人脑胶质瘤细胞BT325增殖、凋亡及线粒体膜电位的影响

目的观察去水卫矛醇(DAG)对人脑胶质瘤BT325细胞增殖、凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。方法将BT325细胞分为对照组、不同浓度DAG组,作相应处理后培养,测算细胞存活率、单细胞克隆形成率、细胞凋亡率及线粒体膜电位。结果随DAG浓度的增加,BT325细胞的存活率逐渐下降(P<0.05),不同浓度DAG组随培养时间的延长BT325细胞的存活率逐渐下降(P均<0.05);培养24、48、72 h时,DAG对BT325细胞的IC50分别为108.81、26.61、11.38μg/m L。不同浓度DAG组BT325细胞克隆形成率均为0,与对照组的16.78%±1.50%相比,P均<0.01。5、10、20、40、80μg/m L的DAG组BT325细胞凋亡率分别为11.79%±2.91%、15.42%±3.06%、38.70%±1.12%、60.78%±1.30%、80.35%±3.22%,对照组为4.27%±1.72%;不同浓度DAG组BT325细胞凋亡率与对照组相比,P均<0.01,且呈浓度依赖性(P均<0.01)。5、10、20、40μg/m L的DAG组BT325细胞线粒体膜电位分别为0.174±0.038、0.142±0.037、0.138±0.033、0.119±0.013,对照组为0.193±0.014;20μg/m L的DAG组与对照组相比,P<0.05;40μg/m L的DAG组与对照组相比,P<0.01。结论 DAG抑制BT325细胞增殖,诱导细胞凋亡,作用呈浓度依赖性,其机制可能与降低细胞线粒体膜电位有关。

二去水卫矛醇对慢性粒细胞白血病疗效的超微结构观察

本文就3例慢粒患者经DAG治疗前后骨髓及外周血中白血病细胞的光镜、电镜所见,讨论了DAG的疗效原理。认为DAG主要作用于分裂间期的幼稚粒细胞,干扰了核酸代谢,从而加速其以“凋落”的形式变性坏死。文中并对少数病理细胞的肿胀、溶解性坏死进行了讨论。

二去水卫矛醇和二乙酰二去水卫矛醇抗肿瘤作用的研究进展

二去水卫矛醇(DAG)和二乙酰二去水卫矛醇(DADAG)在抗肿瘤方面有较强的药理作用,对白血病、脑肿瘤、肝癌、肺癌等皆有效,尤其是治疗慢性粒细胞白血病方面效果较好,鉴于其医疗价值,且DAD和DADAG生物活性多样,可以从多个方面实现抗肿瘤的作用,学者们也将其作用于不同类型的肿瘤细胞,以挖掘更大的应用价值。文章通过综述其对肿瘤的作用及机制,希望能够较为全面地揭示出DAG和DADAG可能的应用方向,为其更好地应用于临床提供启示和思路。

柱前衍生化反相高效液相色谱法测定去水卫矛醇的含量

目的建立测定去水卫矛醇含量的柱前衍生化反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。方法去水卫矛醇经二乙基二硫代氨基甲酸钠衍生化后进行RP-HPLC分析,采用Welch Ultimate XB-CN色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(50∶50),流速为1.0 m L·min^(-1),检测波长为278 nm。结果 40℃下衍生化反应可在30 min内完成,去水卫矛醇衍生物在10 h内稳定。去水卫矛醇在0.100～20.0μg獉m L^(-1)范围内线性关系良好(r=0.999 8)。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为30和100 ng·m L^(-1)。方法专属性、准确度和精密度均符合要求。结论该方法快速、准确、灵敏,具有良好的专属性和重复性,可用于去水卫矛醇的质量控制。

去水卫矛醇对斑马鱼神经发育毒性评价

目的 探讨去水卫矛醇(dianhydrogalactitol,DAG)诱导斑马鱼胚胎及幼鱼神经发育毒性作用及其机制。方法 在一般毒性评价的基础上,对斑马鱼胚胎进行相应的分组暴露给药,采用幼鱼的自主运动反应、光照刺激反应等试验观察DAG对斑马鱼神经及行为的影响;通过脑部组织病理学检查、吖啶橙染色,观察DAG对斑马鱼脑部的组织影响;利用实时荧光定量PCR方法测定斑马鱼幼鱼体内多巴胺神经元相关基因(DAT、TH、GCH1)及神经抑/促凋亡相关基因(Bax、Bcl-2)的相对表达量。结果 DAG在20,40,75 mg·mL^(-1)下能明显抑制斑马鱼的自主运动,且自主运动抑制率呈现明显的浓度相关性;DAG在20,40,75 mg·mL^(-1)下对斑马鱼反应速度有较明显的抑制作用,反应能力下降率呈现浓度相关性;DAG各浓度组斑马鱼脑组织形态变小,但组织结构均未见显著异常;采用吖啶橙染色检测斑马鱼整体胚胎细胞凋亡情况,发现给药组头部绿色荧光比对照组明显,说明细胞凋亡增多,且细胞凋亡呈剂量依赖性增加,与表观一致;DAG在75,150,300,425,600 mg·L^(-1)下可导致斑马鱼幼鱼多巴胺能神经元相关基因DAT、TH、GCH1的mRNA相对表达量下调,Bax/Bcl-2的RNA相对表达量随着给药浓度增加而上升。结论 高浓度DAG对斑马鱼胚胎和幼鱼具有神经发育毒性作用,可能与多巴胺能神经元的抑制作用有关。

定量核磁共振法测定去水卫矛醇的含量

目的:建立定量核磁共振法(qNMR)测定去水卫矛醇的含量。方法:采用核磁共振仪测定一维定量氢谱,90°脉冲,谱宽7 500 Hz,驰豫延迟时间为20s,采样次数为64次测定温度25℃,以对苯二甲酸二甲酯为内标,氘代二甲基亚砜(DMSO-d_6)为溶剂,对去水卫矛醇进行定量研究。结果:qNMR法测定去水卫矛醇的含量为95.82%,与质量平衡法测定结果(96.22%)基本一致。结论:本文建立的qNMR法测定去水卫矛醇的含量准确可靠,简便快速,为该品种的质量控制和对照品赋值提供了新的测定方法。

去水卫矛醇应用于斑马鱼胚胎的安全性评价

目的:利用斑马鱼胚胎评价抗肿瘤药物去水卫矛醇(DAG)的安全性。方法:以受精后6 h(6 hpf)发育正常的斑马鱼胚胎作为实验对象,分别暴露于A,B两个不同实验组的DAG溶液中,A组:98.00,110.00,125.00,141.00,160.00 mg·L^(-1)的低质量浓度剂量组,B组:661.00,871.00,1 148.00,1 514.00,1 995.00 mg·L^(-1)的高质量浓度剂量组,两组均设空白组,每隔24 h更换一次DAG溶液。观察药物处理至不同时间点时斑马鱼胚胎的发育情况,计算半数致死浓度(LC50),半数致畸效应浓度(EC50),治疗指数(TI)和安全指数(SI)。结果:B组斑马鱼胚胎在48 hpf时心率随着DAG浓度增大而下降,48,72,96 hpf孵化率随着观察时间点不同呈现不同趋势,与空白组比较有统计学差异(P<0.01)。斑马鱼胚胎的畸形率和死亡率均随着给药浓度增大和给药时间的延长而增加(P<0.01)。72 hpf的LC50为1 851.33 mg·L^(-1),EC50为184.50 mg·L^(-1),TI为10.03 mg·L^(-1),SI为1.59 mg·L^(-1);96 hpf的LC50为1 071.96 mg·L^(-1),EC50为74.76 mg·L^(-1),TI为14.34 mg·L^(-1),SI为2.94 mg·L^(-1);6 dpf的LC50为133.12 mg·L^(-1)。结论:DAG的浓度与斑马鱼胚胎发育的毒性存在量效关系;DAG作用时间长短与斑马鱼胚胎发育毒性也存在明显的剂量效应。DAG安全性评价指数相对较高。

二去水卫矛醇对人肺癌细胞株体外抗癌活性及机制探讨

目的:研究二去水卫矛醇(DAG)对人肺癌细胞株的体外增殖及凋亡的影响。方法:Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测DAG对11株人肺癌细胞株Calu-1,NCI-H1650,NCI-H358,NCI-H1299,HCC827,PC-9,A549,NCI-H661,NCI-H292,95-D和NCI-H446的体外增殖抑制率,筛选出抑制率相对较高且生长状态良好的细胞;应用台盼蓝拒染法检测DAG作用后的细胞存活率,透射电镜观察细胞凋亡亚显微结构的改变,实时定量荧光PCR(Real-time PCR)检测DAG对细胞内B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达水平的影响。结果:DAG对11株肺癌细胞株均有明显的抑制作用,并呈现出良好的浓度-效应相关性,与空白组比较,随着浓度的增加,细胞的增殖抑制率上升(P<0.01);台盼蓝拒染实验显示随着药物浓度的增加,蓝染细胞数量增多,即死亡或细胞膜遭到破坏的细胞增多;药物作用48 h以后,透射电镜下可见凋亡细胞整体圆缩,微绒毛脱落,核固缩、边集,核内出现高电子密度的异染色质,浓缩成块状,边集于核膜,线粒体肿胀,细胞内出现空泡样变;Real-time PCR结果显示,促凋亡基因Bax表达上调,抗凋亡基因Bcl-2表达下调,Caspase-3被激活。结论:DAG能够抑制肺癌细胞的增殖,并诱导其凋亡,其作用机制可能与上调Bax,下调Bcl-2,激活Caspase-3有关。

二去水卫矛醇的合成

目的研究二去水卫矛醇的合成工艺。方法以植物提取的卫矛醇为起始原料,在0.16 mol·L-1溴酸溶液中进行溴代反应得到二溴卫矛醇(DBD),DBD和碳酸钾在叔丁醇中发生分子内消除反应得到二去水卫矛醇(DAG)粗品,经重结晶得到DAG纯品,并采用正交实验设计法对实验中所涉及的温度、溶剂用量和碱的用量等进行了优化。结果与结论本法原料易得,反应条件温和,后处理简便,适合放大生产,总收率为50%左右,产品纯度和有关物质均符合中华人民共和国药典规定。