贵州光枝勾儿茶内生真菌Diaporthe sp.代谢产物分离鉴定及其抑菌活性研究

为探究黔产苗药光枝勾儿茶中1株具有抗菌活性的内生真菌Diaporthe sp.QX4G6代谢产物的化学成分,并从中筛选抑菌活性化合物,经对菌株Diaporthe sp.QX4G6扩大培养后,利用多种分离方法对代谢产物进行分离纯化,结合光谱技术与文献报道鉴定其结构;以微量肉汤二倍稀释法和平板涂布法分别测定单体化合物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性。结果表明,从Diaporthe sp.QX4G6菌株代谢产物中分离纯化得到4个单体化合物,经核磁共振和质谱分析,分别鉴定为邻苯二甲酸二丁酯(化合物1)、1-[(12E,16E)-12,16-二十碳二烯酰基]-2-[(E,E)-7,10-十八碳二烯酰基]-3-硬脂酰基甘油化合物(2)、3-(4-甲苯氧基)-丙酸(化合物3)、酪醇(化合物4)。抑菌试验结果显示,化合物1—3对大肠杆菌和沙门氏菌均表现出一定的抑制活性,相同条件下对沙门氏菌的抑制作用较强;其中化合物3的抑菌活性最强,对2株细菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为7.81μg/mL和3.91μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)分别为15.63μg/mL和7.81μg/mL。综上,4个化合物均为首次从茎点霉属(Diaporthe sp.)内生真菌代谢产物中分离得到,其中3个化合物在体外对大肠杆菌和沙门氏菌具有一定的抑菌作用,为进一步开发利用光枝勾儿茶内生真菌代谢产物提供科学依据。

First Report of Phomopsis Leaf Spot on Patchouli [Pogostemon cablin( Blanco) Benth. ]Caused by Diaporthe arecae in China

A severe leaf spot disease on patchouli,was observed in Guangdong,China.Early symptom appeared as circular or irregularly shaped and dark brown spots along the leaf margins and tips.As the disease progressed,the spots enlarged and with masses black,sessile conidiomata were observed in lesions.The results of morphology,molecular biology and pathogenicity test indicate that the causal agent of leaf disease of patchouli is Diaporthe arecae.

大豆拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla荧光素酶标记菌株的制备及应用

大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis/Diaporthe longicolla)可侵染大豆引起种腐病和茎枯病等多种病害。本研究根据该病菌基因组的密码子偏好性,优化了外源的荧光素酶基因序列,通过酵母同源重组构建了荧光素酶表达载体,利用PEG介导的原生质体转化法获得了稳定表达荧光素酶的大豆拟茎点种腐病菌菌株PlYC2-1-Luc。结果显示:荧光素酶基因的引入不影响大豆拟茎点种腐病菌的生长速率和致病力。以PlYC2-1-Luc菌株进行示踪可直观发现:健康大豆中分离的3株内生镰孢菌能够显著抑制PlYC2-1-Luc生长,具有生防潜力;含苯醚甲环唑、精甲霜灵·咯菌腈和咯菌腈·噻霉酮的种衣剂均可抑制PlYC2-1-Luc向大豆种子扩展,表明这些药剂或其成分可用于病害防控;PlYC2-1-Luc对大豆品种Williams的致病力强于齐黄34,表明齐黄34更加抗病。该荧光素酶标记方法具有较好的有效性和稳定性,该研究为进一步开展大豆拟茎点种腐病菌的致病机理及病害防控技术研究提供了一种可视化、高效的菌株材料。

基于基因组预测和分析甘薯间座壳菌(Diaporthe batatas)分泌蛋白中效应因子

甘薯间座壳菌(Diaporthe batatas)是引起甘薯基腐病的病原菌之一,近年来在中国东南沿海发生较为普遍。由于效应因子在致病过程中发挥着重要作用,本研究采用SignalP 5.0、GPI-SOM、WoLF PSORT、TMHMM-2.0和EffectorP 3.0等生物信息学软件,对甘薯间座壳菌效应因子进行预测和分析。结果表明,从D.batatas全基因组编码的13864个蛋白质中筛选到359个候选效应因子,其中248个为质外体效应因子,68个为胞内效应因子,43个既可能是质外体效应因子又可能是胞内效应因子。在信号肽分析中,所有候选效应因子信号肽长度为14~37个氨基酸,在信号肽切割位点-3位到+2位出现频率最高的氨基酸分别为丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸。利用HMMER、DIAMOND和eCAMI 3个软件对359个候选效应因子进行碳水化合物活性酶(CAZyme)类分析,结果表明,有89个蛋白质属于CAZyme,其中糖苷水解酶类最多。eggNOG-mapper分析结果显示,在359个候选效应因子中有227个具有功能注释,主要涉及碳水化合物转运和代谢,翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣等生理过程。通过qRT-PCR检测9个候选效应因子基因在D.batatas侵染过程中的相对表达水平,发现有7个候选效应因子基因在侵染过程中显著上调,有2个没有显著变化。这些结果的获得为明确甘薯间座壳菌效应因子的功能,分析甘薯基腐病发病机理,筛选寄主抗性基因及研发特异性靶向农药提供了参考。

野花椒内生真菌Diaporthe perseae次生代谢产物及其抗炎活性

目的研究野花椒内生真菌Diaporthe perseae次生代谢产物及其抗炎活性。方法Diaporthe perseae发酵提取物的次生代谢产物采用硅胶、Sephadex LH-20、TLC、HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。对分离得到的部分化合物进行抗炎活性筛选。结果从中分离得到13个化合物,分别鉴定为蜜环菌酮(1)、2-(4-羟基苯基)乙酸乙酯(2)、N-(2-苯乙基)乙酰胺(3)、4-羟基苯甲醛(4)、环(S-脯氨酸-R-亮氨酸)(5)、环(S-脯氨酸-S-异亮氨酸)(6)、环(S-脯氨酸-R-缬氨酸)(7)、3β,5α-二羟基-6β-乙酰基麦角甾-7,22-二烯(8)、3β,5α-二羟基-10α-甲基-6β-乙酰基麦角甾-7,22-二烯(9)、3β,5α,9α-三羟基-(22 E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-6-酮(10)、3β,5α-二羟基(22 E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-6-酮(11)、(22 E,24R)-ergosta-7,9(11),22-三烯-3β,5α,6β-三醇(12)、5α,6α-epoxy-24(R)-methylcholesta-7,22-dien-3β-ol(13)。化合物5~7抑制NO释放的IC 50值分别为59.37、41.73、58.98μmol/L。结论所有化合物均为首次从该内生真菌中分离得到,化合物5~7为抗炎活性成分。

臭常山内生真菌Diaporthe orixae sp.nov.化学成分研究

目的:研究臭常山内生真菌Diaporthe orixae sp.nov.的化学成分。方法:综合运用硅胶、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、半制备高效液相等色谱技术对臭常山内生真菌Diaporthe orixae sp.nov.提取物的乙酸乙酯部分进行分离纯化,结合理化性质和波谱数据进行结构鉴定。结果:从臭常山内生真菌Diaporthe orixae sp.nov.中分离得到11个化合物,分别鉴定为:mannitol(1)、邻苯二甲酸二甲酯(2)、(R)-6-hydroxymellein(3)、ethyl acetylorsellinate(4)、8-甲氧基补骨脂素(5)、norpestaphthalide A(6)、norpestaphthalide B(7)、tyrosol(8)、de-O-methyldiaporthin(9)、(R,R)-5,7-dihydroxy-3-(1-hydroxyethyl)phthalide(10)、腺苷(11)。结论:以上化合物均为首次从臭常山内生真菌中分离得到,其中,化合物1~7、9~11为首次从该真菌中分离得到。

21种化学药剂对猕猴桃黑点病菌(Diaporthe phaseolorum)的室内毒力及田间防效

旨在筛选猕猴桃黑点病防治药剂并明确其防治效果。采用菌丝生长速率法,测定21种不同化学药剂对猕猴桃黑点病菌的毒力,并选择其中16种药剂进行田间药效试验。结果显示,烯肟·戊唑醇w=20%悬浮剂(SC)等9种药剂对黑点病菌具有极强的抑菌效果,其EC_(50)值均达0.05~1.12μg/mL,表现为极度敏感;其次为抑霉唑w=20%水乳剂EW、辛菌胺醋酸盐w=1.8%水剂(AS)及腐霉利w=50%可湿性粉剂(WP),其EC_(50)值为14.02~37.37μg/mL,表现为高度敏感;氨基寡糖素w=5%(AS)、嘧环·咯菌腈w=62%水分散粒剂(WG)和吡唑醚菌酯w=25%乳油(EC)的EC_(50)值分别为118.49μg/mL、195.32μg/mL和255.18μg/mL,表现为中度敏感或低度敏感;而苯醚甲环唑w=10%(WG)等6种药剂其EC_(50)值分别远大于350μg/mL,为不敏感;供试的16种药剂在田间均表现出极显著防治效果,其中:苯甲·丙环唑w=30%(EC)450 g/hm^(2)、氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑w=20%(SC)600 g/hm^(2)、嘧环·咯菌腈w=62%(WG)600 g/hm^(2)、腈苯唑w=24%(SC)900 g/hm^(2)、丙环唑·嘧菌脂w=18.7%(SC)600 g/hm^(2)、啶酰·咯菌腈w=30%(SC)900 g/hm^(2)及戊唑醇w=43%(SC)450 g/hm^(2)7种药剂处理平均防效达到84.32%~90.36%;其次为烯肟·戊唑醇w=20%(SC)900 g/hm^(2)、抑霉唑w=20%(EW)900 g/hm^(2)、吡唑醚菌酯w=25%(EC)720 g/hm^(2)、腐霉利w=50%(WP)750 g/hm^(2)、寡糖·吡唑酯w=27%(EW)900 g/hm^(2)及硝酸氨钙可溶性粒剂(SG)1500 kg/hm^(2)6种药剂处理,平均防效达到64.92%~81.78%;而其他3种药剂处理防效略差。结果表明,30%苯甲·丙环唑EC、20%氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC、62%嘧环·咯菌腈WG、24%腈苯唑SC、18.7%丙环唑·嘧菌脂SC、30%啶酰·咯菌腈SC、43%戊唑醇SC、20%烯肟·戊唑醇SC、20%抑霉唑EW、25%吡唑醚菌酯EC、50%腐霉利WP、27%寡糖·吡唑嘧菌酯EW 12种药剂及土施农用硝酸氨钙SG对猕猴桃黑点病均具有良好的防治效果,可作为今后防治猕猴桃黑点病的优选药剂。

云南美登木内生真菌Phomopsis sp．Lz42的化学成分

从云南美登木内生真菌Phomopsis species Lz42的琼脂平板发酵物中分离得到2个倍半萜和5个麦角甾醇类化合物(1～7),其中化合物1和2为新化合物.应用波谱技术确定其结构为4-Deacetyl-10-oxo-di-hydrobotrydial(1)和麦角甾-6,22-二烯-5α,8α-环二氧-3-甲酸酯(2).

大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)对大豆种子致病性及侵入部位研究

大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla Hobbs)可引起大豆种腐病,严重影响大豆产量和品质。为探讨大豆拟茎点种腐病菌对大豆种子发芽的影响及侵染种子的部位,在实验室条件下采用种子接菌法进行了研究。结果表明,大豆拟茎点种腐病菌可明显降低种子的发芽势和发芽率。侵入部位包括种子的种皮、子叶及胚,严重影响种子活力。

印楝植物内生真菌Phomopsis sp.的代谢产物研究

从印楝植物内生真菌Phomopsissp.的菌丝体提取物中分离得到4个化合物,通过波谱技术分别鉴定为水苏碱(1)、甲基-β-D-葡萄糖苷(2)、过氧化麦角甾醇(3)、腺嘌呤核苷(4),这些化合物均为首次从该属真菌中分离得到。

茄子对褐纹病(Phomopsisvexans)的抗性遗传研究

选用茄子褐纹病抗源品系８３ － ０２ ，配制相应的世代，研究茄子对褐纹病的抗性遗传规律。结果表明：抗源品系８３ － ０２ 对褐纹病菌的抗性遗传是由一对显性基因控制的简单遗传，将该抗褐纹病的基因符号取名为Ｒｐｈ 和ｒｐｈ。

龙眼拟茎点霉(Phomopsis longanae Chi)的生物学特性研究

龙眼拟茎点霉（Phomopsis longanae Chi）是导致采后龙眼果实腐烂的主要病原菌,研究了温度、湿度、pH值、光照、营养、越冬越夏等条件对龙眼拟茎点霉菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响。结果表明：龙眼拟茎点霉生长适温为25℃,最适pH6~7;产生子座的最适温度为22~25℃,最适pH6,还需要一定的光照;以蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和D-果糖为碳源和以蛋白胨、硫酸铵和硝酸铵为氮源的培养基最有利于龙眼拟茎点霉的生长发育;分生孢子的大量萌发要求高湿度和营养刺激,最适萌发温度25~28℃,最适pH6~7,在分生孢子器中,分生孢子的存活时间长于1年;该菌菌丝的致死温度为59℃（10 min）,分生孢子为50℃（10 min）。

杨梅叶枯病菌(Phomopsis myricina)生物学特性研究

杨梅叶枯病菌(Phomopsismyricina)生物学特性研究结果表明:该菌菌丝生长与分生孢子器形成最佳培养基为PSA+1‰酵母膏和PDA+1‰酵母膏。病菌能有效地利用多种碳源和氮源．但谷氨酸和精氨酸对病菌生长发育有抑制作用。菌丝生长和分生孢子器形成最适温度为20-25℃:最适pH值分别为6-8和7-9。紫外光处理有利于产孢。分生孢子萌发最适温度为20-30℃;最适pH值7-9;在相对湿度98％以上和水滴中孢子萌发率最高;不同营养对孢子萌发无显著影响。

巴戟天内生真菌Diaporthe lithocarpus的次级代谢产物及其细胞毒活性研究

目的:研究巴戟天内生真菌Diaporthe lithocarpus A740的次级代谢产物及其细胞毒活性。方法:采用正、反相硅胶柱、凝胶柱和高效液相等多种色谱技术对菌株A740的固体发酵产物进行分离纯化,并通过NMR、MS等波谱方法鉴定化合物结构,采用SRB法对得到的单体化合物进行细胞毒活性测试。结果:从菌株A740的发酵产物中分离纯化得到13个化合物,分别鉴定为:2⁃羟基苯乙酸乙酯(1)、4⁃(2⁃羟乙基)苯甲酸(2)、4⁃羟基苯乙酸乙酯(3)、4⁃甲基⁃5,6⁃二氢吡啶⁃2⁃酮(4)、(3R,4R)⁃cis⁃4⁃hydroxy⁃5⁃methylmellein(5)、viridianol 1(6)、5⁃羟基⁃7⁃甲氧基⁃4,6⁃二甲基⁃1⁃(3H)异苯并呋喃酮(7)、phomopene(8)、diaporisoindole B(9)、diaporisoindole A(10)、p⁃苯三醇(11)、异戊二烯基异苯并呋喃A(12)、lithocarin A(13)。结论:其中,化合物1~7为首次从Diaporthe属真菌中分离得到。化合物10、12和13对神经癌细胞(SF⁃268)、人乳腺癌细胞(MCF⁃7)、人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞株(A549)四株肿瘤细胞株具有细胞毒活性,其中化合物10对这四种肿瘤细胞株的IC50为23.96~35.19μmol/L。

深海真菌Diaporthe phaseolorum FS431次级代谢产物的分离鉴定

目的研究深海真菌Diaporthe phaseolorum FS431的次级代谢产物。方法采用正、反相硅胶柱层析色谱法、Sephadex LH-20凝胶柱色谱法和高效液相色谱法等多种色谱方法对菌株FS431的液体发酵产物进行分离纯化,并通过NMR、MS等波谱技术鉴定化合物结构。结果从发酵物中分离得到9个化合物,分别鉴定为:nectriapyrone(1)、pestalotiopyrone B(2)、nectriapyrone B(3)、(R)-甲羟戊酸内酯(4)、3,5-dihydroxy-γ-caprolactone(5)、cytochalasin H(6)、cytochalasin J(7)、脱落酸(8)和(1R,2R,4R)-trihydroxy-p-menthane(9)。结论化合物2、4、5和8首次从Diaporthe属真菌中分离得到。

头花蓼内生真菌Diaporthe sp.代谢产物中的抗菌活性成分研究

目的:研究头花蓼内生真菌Diaporthe sp.代谢产物中的抗菌活性成分。方法:采用硅胶色谱、Sephadex LH-20及半制备高效液相色谱等分离方法对内生真菌Diaporthe sp.的代谢产物进行分离纯化,运用MS、1H-NMR及13 C-NMR等现代波谱分析技术对分离得到的单体化合物进行结构鉴定,采用96孔板二倍稀释法对单体化合物进行抗菌活性研究。结果:从内生菌代谢物中分离得到化合物11个,分别为胸腺嘧啶核苷(1)、2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(2)、尿嘧啶核苷(3)、对羟基苯甲醛(4)、alternariol(5)、2-甲基-3,5-羟基色酮(6)、尿嘧啶(7)、(-)-(3 R)-mellein methylether(8)、3-(2 R,4 S-dihydroxypentyl)-6,8-dihydroxyisocoumarin(9)、2-(4-hydroxyphenyl)ethylacetate(10)和对羟基苯乙醇(11),化合物1~3和7~10为Diaporthe属首次报道;抗菌活性测试显示,化合物5、6、8及9对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为16~32 mg/L,化合物5对金黄色葡萄球菌的MIC为32 mg/L。结论:化合物5、6、8及9为头花蓼内生真菌Diaporthe sp.代谢产物中的抗菌活性成分。

一株拟茎点霉(Phomopsis sp.SC1104)菌株的分离鉴定及对桑椹的致病性试验

从表现桑椹菌核病病症的桑树病果中分离到一株优势真菌菌株,菌株在PDA平板上培养的菌落外观特征与在染病桑椹(病果)小核果间菌丝发育形成的菌核病菌类似,均出现黑色菌丝团,但新分离株的黑色菌丝团不形成菌核。通过对菌株r DNA ITS 583 bp片段序列(Gen Bank登录号:KT824639)的PCR检测,并结合菌株的形态学特征和系统发育分析,初步鉴定该菌株属于拟茎点霉(Phomopsis sp.SC1104)。该菌株的致病性试验表明,桑树花期受感染后,在桑椹即将成熟时表现出病理特征,病果整个或者部分呈白色,在病果的小果间出现不规则的黑色菌丝团,并能从病果中重复分离和检测到相同的病菌。试验分析显示Phomopsis sp.SC1104菌株可感染桑椹致病,推测该菌株或作为潜伏性病原菌在桑椹菌核病的大面积暴发中扮演了重要角色。

青灰叶下珠内生菌Phomopsis sp.TJ507A的化学成分及生物活性研究

为探究药用植物青灰叶下珠(Phyllanthus glaucus)来源内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp. TJ507A)的化学成分,本实验联合运用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、凝胶柱色谱(Sephadex LH-20)、半制备型高效液相色谱(HPLC)等分离技术,从该菌株大米固体发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离得到4个倍半萜化合物phomophyllin O(1)、phomophyllin P(2)、7-hydroxy-10-methoxydehydrodihydrobotrydial(3)、plorantinone D(4)和8个甾体化合物fortis-terol(5)、dankasterone B(6)、(14α,22E)-14-hydroxy-ergosta-7,22-diene-3,6-dione(7)、(14α,22E)-14-hydroxyerg-osta-4,7,22-triene-3,6-dione(8)、calvasterol B(9)、isocyathisterol(10)、ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one(11)和ganodermaside D(12)。化合物1和2为新化合物,运用现代波谱分析技术、[Rh2(OCOCF3)4]络合诱导ECD法及与文献对比等方法,鉴定了化合物1和2的结构和绝对构型。化合物1～5、7、8和10均为首次从该属真菌中分离得到。通过体外生物活性评价,发现化合物9具较强的NO生成抑制活性(IC508. 7μM)。

南海红树林内生真菌Phomopsis sp.ZZF08酰胺类次级代谢产物

采用色谱技术对红树林内生真菌Phomopsis sp.ZZF08代谢产物进行分离纯化,MS、NMR、X-单晶衍射及与文献数据比对等方法确定其结构,MTT法考察其对体外人鼻咽癌细胞KB和KBv200的毒性作用。结果表明,由红树林内生真菌Phomopsis sp.ZZF08培养液中分离得到12个酰胺类化合物,经鉴定,分别为viridicatol(1)、cytochalasin H(2)、cytochalasin IV(3)、葡萄糖神经酰胺(4)、△^(4(5))(E)-鞘氨醇-正十六碳酰胺(5)、尿囊素(6)、胸腺嘧啶(7)、尿嘧啶(8)、环(亮-甘)二肽(9)、环(亮-丙)二肽(10)、环(苯丙-甘))二肽(11)和环(苯丙-丙)二肽(12),其中,化合物1,2,3,4,5为首次从湛江红树林内生真菌Phomopsis sp.中发现。体外细胞毒性实验表明化合物2,3对KB细胞和KBv200细胞有较强细胞毒性。

青皮内生菌Phomopsis sp.固体发酵产物的分离纯化

目的:依据内共生理论,从青皮内生菌Phomopsis sp.固体发酵产物中寻找与宿主植物相同或相似的药理活性成分。方法:利用硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析、反相柱层析以及高效液相色谱等方法对青皮内生菌Phomopsis sp.固体发酵产物进行分离纯化,并采用1 H-NMR谱、13 C-NMR谱和质谱等技术鉴定单体化合物的结构。结果:从组分QLB-SZP中分离获得一个单体化合物QLB-SZP-1(4mg)。结论:内生菌Phomopsis sp.产生的代谢产物结构类型丰富,可以为天然药物研究提供化合物来源。