大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC的结构特性及刺激Caco-2细胞作用的研究

试验旨在分析大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC(FliC_(EcN))的结构特征及其对Caco-2细胞的刺激作用。试验通过大肠杆菌BL21(DE3)表达FliCEcN蛋白、经NTA柱纯化FliC_(EcN)蛋白并通过SDS-PAGE和Westernblot验证,利用SOPMA和Alphofold2预测FliC_(EcN)蛋白的结构模型、表面增强拉曼光谱和圆二色谱解析FliC_(EcN)蛋白的结构,使用FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞后,检测免疫相关因子的分泌水平。结果显示,FliC_(EcN)蛋白的大小为64kDa,能够被抗His单克隆抗体特异识别;FliC_(EcN)蛋白的氨基和羧基末端主要由α-螺旋组成,中间结构域主要由β-折叠组成。FliC_(EcN)蛋白酰胺Ⅰ区最大吸收峰均位于1656 cm^(-1)处,主要二级结构为α-螺旋和β-折叠;FliC_(EcN)的α-螺旋占比44.4%,β-折叠占比23.4%,β-转角占比13.5%,无规则卷曲占比19.0%;FliC_(EcN)蛋白能够有效刺激Caco-2细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10);随着刺激时间延长,IL-6的分泌水平呈下降趋势,IL-10和TNF-α的分泌水平呈增加趋势。研究表明,α-螺旋和β-折叠是构成FliC_(EcN)的主要结构,可促进其构象的正确折叠和维持其三维结构稳定,FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-α的水平存在差异。

圆二色光谱法实验教学的探索

设计了手性分子构型分析的圆二色光谱实验,并将其应用于学生仪器培训教学中。实验中,以一对(S)-和(R)-5-羟基-2-哌啶酮为切入点,通过核磁谱图确定其结构,利用圆二色光谱仪对其进行构型测试。根据圆二色光谱Cotton效应确定,(R)-5-羟基-2-哌啶酮在215nm出现正的Cotton效应,(S)-5-羟基-2-哌啶酮在215nm出现负的Cotton效应。实验的开展巩固了学生对圆二色光谱多方面知识的了解,激发了学生的热情,培养了学生的综合能力。

光谱法研究Cu^2＋与肌红蛋白的相互作用

用紫外吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱及圆二色(CD)谱研究了Cu2+与肌红蛋白(Mb)的相互作用.结果发现,Cu2+使Mb的紫外吸收增强,峰位蓝移,说明Cu2+与Mb发生了较强的相互作用;Mb的特征荧光峰猝灭,且随着温度升高猝灭常数Ksv降低,表明Cu2+对Mb的荧光猝灭机制属于静态猝灭;计算了不同温度下的结合常数和结合位点数;由van′tHoff方程计算出ΔH和ΔS分别为-11.60kJ/mol和33.77J.(mol·K)-1,得出二者之间的作用力主要为静电力;并依据Frster非辐射能量转移理论确定了给体-受体间的结合距离r=2.56nm.同步荧光光谱表明,Cu2+对Mb的构象产生影响,使色氨酸残基的疏水性下降.CD光谱测得加入Cu2+后,二级结构发生改变,使α-螺旋含量降低.

筒鞘蛇菰的化学成分研究

目的研究筒鞘蛇菰Balanophora involucrata的化学成分。方法用硅胶柱色谱、高效液相色谱、NMR、ESI-MS、EI-MS和圆二色光谱等各种波谱和光谱方法对该植物醋酸乙酯萃取部位的化学成分进行分离鉴定。结果共分离鉴定了10个单体化合物,包括1个异香豆素、2个苯丙烯酸葡萄糖苷和7个黄酮化合物。分别是(2R)-圣草酚-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅰ)、(2S)-圣草酚-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ)、根皮苷(Ⅲ)、3-羟基根皮苷(Ⅳ)、三叶苷(Ⅴ)、(反式)-3,4,2′,4′,6′-五羟基查尔酮-2′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅵ)、金鱼草素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅶ)、(反式)-1-O-对香豆酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅷ)、(反式)-1-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅸ)、短叶苏木酚酸甲酯(Ⅹ)。结论以上化合物均为首次从该植物中分离得到,其中化合物Ⅰ为新化合物,命名为筒鞘蛇菰苷(balaninvolin)。

大黄酸铜(Ⅱ)配合物与牛血清白蛋白的相互作用

采用荧光光谱法、紫外光谱法和圆二色光谱法并结合电化学方法,研究了大黄酸铜配合物与牛血清白蛋白之间的相互作用.结果表明,大黄酸铜配合物能显著猝灭牛血清白蛋白的内源荧光并以静态猝灭为主;计算了298和309 K温度下的结合常数和结合位点,热力学参数和大黄酸铜配合物的电化学行为说明大黄酸铜配合物与牛血清白蛋白之间具有较强的疏水作用力;依据F rster的偶极-偶极非辐射能量转移理论,计算出大黄酸铜在蛋白质中的结合位置与色氨酸残基间的距离为3.21 nm,表明大黄酸铜的部分片段能够插入蛋白质分子内部;探讨了大黄酸铜配合物对牛血清白蛋白构象的影响.

L-谷氨酸桥联的卟啉二联体的合成和表征及其CD光谱研究

通过L谷氨酸(乙酰基保护)与二氯亚砜反应制备的二酰氯和单羟基卟啉(MPH2)反应,合成了L谷氨酸桥联的卟啉二联体,用红外光谱、电子吸收光谱、核磁共振氢谱、元素分析和质谱对化合物的结构加以确证,通过圆二色谱(CD)研究了化合物的手性特征.

使用圆二色性光谱和红外光谱研究冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构

使用圆二色性光谱和红外光谱技术对冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构进行了研究。由于冬小麦麸皮抗冻蛋白在酰胺Ⅰ带和Ⅲ带位置中,各个特征峰相互叠加,因此采用Gausse峰型对圆头峰进行拟合、解析,判断其α-helix,β-sheet,β-turn和Random coil的相对含量;同时对圆二色性光谱获得的结构信息,采用按照Chen-Yang原理和最小二乘法编写的程序计算了冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构。最后,讨论了两种检测方法结果差异的原因,为冬小麦麸皮抗冻蛋白抗冻机理的研究奠定基础。

一类新型手性表面活性剂的研究

制备了一对旋光异构的两亲分子L-C10HL(N-(4-癸氧基-2-羟基苯亚甲基)-L-亮氨酸)和D-C10HL(N-(4-癸氧基-2-羟基苯亚甲基)-D-亮氨酸).对相应的表面活性和聚集体研究发现,C10HL与传统羧酸盐表面活性剂有很大的不同,在较高pH时仍具有较高的表面活性和聚集能力.利用荧光激发光谱和圆二色性谱研究了L-C10HL和D-C10HL与环糊精之间的相互作用.

1-[4-(二甲氨基)苯亚甲基氨基]-4-苯基硫脲的合成及手性晶体结构

对二甲氨基苯甲醛和苯基氨基硫脲缩合反应生成1-[4-(二甲氨基)苯亚甲基氨基]-4-苯基硫脲{1-[4-(dimethyl-amino)benzylidene]-4-phenylthiosemicarbazide},并从溶液中析出手性晶体.元素分析、红外光谱、紫外光谱、核磁谱、质谱和X射线衍射测定其组成和结构.晶体属正交晶系,P212121空间群,a=0.77038(14)nm,b=1.1428(2)nm,c=1.6726(3)nm,V=1.4726(5)nm3,Z=4,Dc=1.346g/cm3,F(000)=632,μ=0.219mm-1,可观测点精修最终偏离因子:R=0.0407,wR=0.1157.化合物的晶体结构和固态圆二色谱表明化合物在结晶过程中发生单一对映体的手性堆积.

大米蛋白的酶水解机制研究——Ⅱ酶水解过程中蛋白质的组分变化

凝胶色谱和高效液相色谱分析表明,大米蛋白在碱性蛋白酶Alcalase水解过程中,其可溶性蛋白组分的相对分子质量(Mr.)分布范围相对稳定,但Mr.1350u以下小分子组分的相对含量不断增加;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,随着酶水解反应的进行,Mr.为57、39、26、22ku的亚基逐渐消失,而29ku和13ku两个亚基的含量相应增加,且这两个亚基表现出可抵抗酶水解的特性。氨基酸分析表明,酶解后残余物蛋白中胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的含量显著高于可溶性蛋白中的含量。圆二色光谱(CD)分析显示,酶水解前后大米蛋白的二级结构发生显著变化,在残余物蛋白质组分中自由回转的比例高达71.3%,α-螺旋结构完全消失。

重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。

含轴向咪唑配体的手性SalenCo(川)配合物ECD谱的理论解析

用密度泛函理论(DFT)方法,在B3LYP和混合基组(C,H原子用6-31 G*;Co,N,O用6-31 1+G(2d,p))水平上,对含轴向配体的三种Co(Ⅲ)席夫碱配合物[Co(MeO-salen)(国m)_2]^+、[Co(MeO-salen)(2-Melm)_2]^+和[Co(MeO-salen)(Melm)_2]^+(lm=咪唑,Melm=1-甲基咪唑,2-Melm=2-甲基咪唑,MeO-salenH2=salen型席夫碱,即(R,R)-N,N'-双(5-甲氧基亚水杨基)-1,2-二亚胺基环己烷)在二氯甲烷溶液中的基态结构进行了优化,并用含时密度泛函理论(TDDFT)方法,在相同泛函和基组水平上计算了其激发能、振子强度和旋转强度.这些计算中均用极化连续介质模型(PCM)考虑了溶剂效应.计算的电子圆二色(ECD)谱与实验谱吻合较好.通过对有关跃迁性质的分析,对实验电子圆二色光谱进行了解析与指认.结果表明,长波区的第一个园二色(CD)吸收带主要是由π→d荷移跃迁(LMCT)引起的,而不是通常认为的d→d跃迁.轴向配体的加入对配合物前两个CD吸收带的符号没有影响,但会影响带形和强度.手性salen配合物的绝对构型为λ(RR)时,第一个CD吸收带为正,第二个为负.这些结论对于深入理解该类配合物的电子结构和手征光学性质具有重要的科学意义.

截短胰高血糖素样肽-1的构象研究

截短胰高血糖素样肽-1(sGLP-1)不仅具备刺激胰岛β细胞增生和降低血糖的功能,而且半衰期较长,具有非常好的新药开发前景.为了阐明sGLP-1的功能,本文运用圆二色光谱和荧光光谱探究了sGLP-1在不同条件下的构象,结果表明,sGLP-1在磷酸盐缓冲液中主要呈无规则构象,螺旋含量很低;在含十二烷基硫酸钠或三氟乙醇的磷酸盐缓冲液中主要呈螺旋构象.溶液pH值和温度变化对sGLP-1的构象影响显著.sGLP-1保留了结合并激活受体的关键残基,在受体的诱导下,在体内形成正确构象,从而结合并激活受体,发挥它的功能.研究结果表明,适当缩短GLP-1C端片段,能获得作用时间长、效力高的GLP-1类似物.

新型Salen型配合物的合成和表征及轴向配位热力学

采用金属模板法合成了四个新型Salen型单、双核金属配合物,并用元素分析、核磁共振(1HNMR)、电喷雾质谱(ESI-MS)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)等手段进行了表征.使用紫外-可见(UV-Vis)光谱滴定法和圆二色(CD)光谱研究了主体金属镍配合物与咪唑类含氮小分子的轴向配位反应热力学性质.结果表明:主体与咪唑(Im)和N-甲基咪唑(N-MeIm)的配位数是2,而与2-Et-4-MeIm和2-MeIm的配位数是1;轴配体系的热力学数据显示主体与咪唑类配体的平衡常数按K苓(Im)>K苓(N-MeIm)>K苓(2-Et-4-MeIm)>K苓(2-MeIm)顺序依次减小;测得的△rHm苓和△rSm苓数据表明该轴向配位反应为放热、熵增加过程.

甘草次酸对Bloom解旋酶生物学特性的影响

甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是甘草主要活性组分,可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长.然而,其对BLM解旋酶的抑制作用尚未见报道.本文注视甘草次酸对BLM解旋酶构象、二级结构和生化活性的影响.圆二色光谱和紫外光谱分析显示,GA可破坏BLM642-1290解旋酶α-螺旋结构,改变其构象,并具有2个结合位点.采用荧光偏振技术和自由磷检测证明,GA以浓度依赖的方式抑制BLM642-1290解旋酶与底物dsDNA及ssDNA的结合,抑制BLM642-1290解旋酶活性及ATP酶活性,且抑制类型为混合抑制.综上所述,本文证明GA可通过结合BLM解旋酶,改变BLM解旋酶构象,抑制BLM解旋酶与DNA的结合,从而抑制BLM解旋酶的生化活性.我们的发现将对深入认识GA的抗肿瘤作用有新的启示.

苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸类物质与α-淀粉酶的相互作用特性

探讨苦丁冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸(caffeoylquinic acids,CQA):3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-di CQA、3,5-di CQA和4,5-di CQA对α-淀粉酶的体外抑制活性,并采用荧光光谱法和圆二色谱法分析CQA与α-淀粉酶的相互作用特性,使用修正后的Stern-Volmer方程与van’t Hoff方程探讨CQA-酶之间的结合常数、结合位点数及热力学参数。结果表明:3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-di CQA、3,5-di CQA和4,5-di CQA对α-淀粉酶均有较强的抑制作用,半抑制浓度(IC_(50))分别为1.54、1.05、1.28、0.96、0.33、0.64 mg/m L;CQA与α-淀粉酶发生结合反应,生成稳定的复合物,从而造成酶分子内部荧光发生猝灭;热力学参数分析表明CQA与α-淀粉酶主要靠疏水作用力结合,反应自发进行。此外,圆二色谱结果显示CQA的结合引起α-淀粉酶二级结构的变化,破坏了酶蛋白的天然构象,从而降低了酶的催化活性。

牛α-乳白蛋白-亚油酸复合物的结构及抗肿瘤活性

利用内源性荧光光谱、荧光探针(ANS)结合荧光光谱及圆二色谱,以乳白蛋白-油酸为参照,研究了乳白蛋白结合亚油酸后,疏水性氨基酸、疏水性区域、三级结构及二级结构的变化,并利用亚甲基蓝的方法评价了该复合物的抗肿瘤活性。荧光光谱结果显示,与乳白蛋白-油酸复合物类似,乳白蛋白结合亚油酸后,其内源性荧光光谱显著红移,从331.07nm移至337.60nm;外源性ANS结合光谱蓝移,从516.20nm移至508.50nm;且荧光强度增加,表明乳白蛋白结合亚油酸后同样出现了疏水性氨基酸及疏水性区域暴露的现象。圆二色谱结果表明,与乳白蛋白-油酸复合物类似,乳白蛋白结合亚油酸后,三级结构部分丧失,二级结构中β-转角及无规卷曲的含量显著降低,β-折叠含量增加。细胞实验证实了乳白蛋白-亚油酸复合物具有良好的抗肿瘤效果。该研究从复合物结构和功能的两方面,为新型抗肿瘤乳白蛋白-亚油酸复合物的开发提供了依据。

巴马小型猪SLA-2和β_2m复合体蛋白的构建及二级结构测定分析

以巴马小型猪为研究材料,克隆SLA-2和β2m基因。然后采用剪接重叠延伸PCR(Splicing overlap exten-tion PCR,SOE PCR)法,将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3连接,形成SLA-2-Linker-β2m。将SLA-2-Linker-β2m在pMAL-p2X系统上表达,其融合表达蛋白分别经过West-ern-blot、纯化及Factor Xa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)测定蛋白的二级结构。结果显示,重构表达的复合体融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m大小为84.1 ku。切割后去除MBP的单体蛋白大小为41.6 ku。圆二色谱分析单体蛋白和融合蛋白二级结构元件α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲的符合率分别达到了100%、97.3%、97.1%和97.9%,揭示重构的复合体具有正确的二级结构,可以用于体外多肽结合等研究。

人β防御素1～4抑菌及盐敏感性研究

目的对人β防御素(hBD)1～4的抑菌及盐敏感性进行测定并分析其二级结构对抑菌及盐敏感性的影响。方法圆二色谱预测hBD 1～4的二级结构,应用抑菌实验来测定抑菌效力,提高溶液中的NaCl浓度来进行盐敏感性分析。结果获得了4种hBD的圆二色谱谱图并进行分析。实验发现hBD-1抑菌活力低,抑菌谱窄,hBD-2、hBD-4抑菌活力好于hBD-1,抑菌谱也更广,但是对盐耐受力差,而hBD-3在这4种防御素中拥有最强的抑菌活性及耐盐效力。结论 4种hBD具有不同的抑菌活性和盐敏感性。防御素的理化性质与二级结构共同决定了抑菌活力及其盐敏感性。

光谱法研究pH值对再生桑蚕丝素蛋白在水溶液中结构的影响

通过一系列光谱实验手段研究了再生桑蚕(Bombyxmori)丝素蛋白在水溶液中的构象转变情况.由于丝素蛋白含有较多带电荷的氨基酸残基,因此环境pH值对丝素蛋白的结构有着一定的影响:酸性越强,丝素蛋白越容易发生从无规线团到β-折叠结构转变;相对而言,碱性条件则更有利于丝素蛋白以无规线团结构稳定存在.特别是当pH在4附近时,丝素蛋白的无规结构最易发生改变;而pH为6左右时,丝素蛋白的结构则较为稳定.这种变化趋势与沿着成熟蚕腺体中丝素蛋白所处的环境及其状态相当吻合,由此表明pH值的调节是蚕在生物体中控制其丝素蛋白状态的一个相当重要的手段.这一结果对人工纺制动物丝条件的调控有着极其重要的现实意义.同时我们还发现,在相当宽的pH范围内,丝素蛋白的二级结构存在着中间体形态,表明丝素蛋白的变性过程不符合简单的二态机制.