多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利敏感基线的建立及抗药性监测

为明确我国山东和辽宁地区多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利的抗药性现状,采用菌丝生长速率法,测定了多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利的敏感性,建立了敏感基线;采用区分剂量法,测定了多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利的抗药性。结果表明,乙霉威和腐霉利对多主棒孢敏感菌株的平均EC50值分别为(0.22±0.06)μg·mL^(-1)和(2.75±0.91)μg·mL^(-1),两者的敏感性频率均呈连续性单峰曲线,总体呈正态分布,可作为多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利的敏感基线。对采集自山东和辽宁地区的828株多主棒孢菌进行抗性水平监测,发现多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利的抗性水平不断升高,山东地区多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利抗性频率从2017年的58.06%和43.55%上升到2021年的91.30%和78.99%,辽宁地区多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利抗性频率从2017年的67.44%和53.49%上升到2021年的82.14%和83.33%。表明多主棒孢菌对乙霉威和腐霉利具有高度的抗性风险,建议在黄瓜生产中乙霉威和腐霉利与其他类型杀菌剂交替或者混合应用,延缓抗药性的发展。

葡萄灰霉病菌对3种杀菌剂的多重抗药性检测

【目的】为检测葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威3种杀菌剂的多重抗药性,指导生产上葡萄灰霉病的药剂防治。【方法】从甘肃、山东、北京等14个省、市、自治区采集葡萄灰霉病样分离纯化得到109个灰葡萄孢(Botrytis cinerea)单孢系菌株,采用最低抑制浓度法(MIC)测定了葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类(多菌灵)、二甲酰亚胺类(腐霉利)和氨基甲酸酯类(乙霉威)杀菌剂的多重抗药性。【结果】结果表明,葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威的抗药性菌株率分别达到了83.5%、14.7%和17.4%;抗药性类型有BenRDicSNPCS、BenRDicRNPCS、BenRDicRNPCR和BenSDicSNPCR4种,所占比例分别为68.8%、13.8%、0.9%和16.5%。【结论】我国不同地区的葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和氨基甲酸酯类杀菌剂普遍存在抗药性问题,对多菌灵的抗药性较为严重,因此,在生产上,应选择一些替代的新型杀菌剂和生物农药。

浙江省葡萄炭疽菌对甲基硫菌灵和戊唑醇的抗药性研究

【目的】了解浙江地区葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)对苯并咪唑类杀菌剂和甾醇脱甲基抑制剂(DMI)类杀菌剂的抗药性现状,为其防治提供依据和指导。【方法】采用区分剂量法测定了浙江省临安市、诸暨市和金华市的3个葡萄重要产区的108个葡萄炭疽病菌株对甲基硫菌灵和戊唑醇的抗药性,并对甲基硫菌灵敏感和抗药性菌株中的β-tubulin基因进行了扩增、测序和比较。【结果】所采集菌株群体对甲基硫菌灵的抗药性频率为37.04%,且均为高水平抗药性菌株(Ben HR),Ben HR对多菌灵和乙霉威表现双重抗药性,其β-tubulin基因的第200位密码子从TTC突变为TAC,导致第200位氨基酸从苯丙氨酸(Phe)突变为络氨酸(Tyr)。所采集菌株群体共检测到33个(30.56%)对戊唑醇表现低水平抗药性的菌株。【结论】浙江地区葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵、乙霉威产生了严重的抗药性,对DMIs类杀菌剂戊唑醇的抗药性发展迅速。

番茄叶霉病菌对多菌灵、乙霉威及代森锰锌抗性检测

报道了番茄叶霉病菌Fulviafulva对多菌灵、乙霉威及代森锰锌的敏感性基线,以及抗性频率和抗性水平。离体条件下,多菌灵、乙霉威及代森锰锌对番茄叶霉病菌敏感菌株的平均EC50值分别为0.101、2.475、9.067μg/mL;最低抑制浓度(MIC)值分别为0.5、5、50μg/mL。山西晋南地区番茄叶霉病菌对3种杀菌剂的抗性频率最高,分别达到97.4%、70.5%、98.7%;山西吕梁地区与太原地区相对较低,但该病菌对3种杀菌剂的抗性频率也都超过了30%。辽宁沈阳、山东寿光、河北保定番茄叶霉病菌对多菌灵的抗性频率均为100%;对乙霉威的抗性频率前两地为100%,保定为10%;对代森锰锌的抗性频率都超过90%。所有抗性菌株对多菌灵均属于高抗类型,抗性指数超过5000,测不出MIC值;对乙霉威有50%的高抗菌株,抗性指数在100以上;对代森锰锌各地均未发现高抗菌株,低抗和中抗菌株所占比例较大,其抗性指数集中在50左右。对多菌灵与乙霉威具有双重抗性的菌株占测试菌株总数的49.9%,并且首次在田间发现了对3种杀菌剂都具有抗性的番茄叶霉病菌多抗菌株。

北京地区番茄灰霉病菌的多重抗药性检测

2009年12月-2010年5月,在北京12个郊区县采集番茄病标样150份,分离纯化得到109个灰葡萄孢(Botrytis cinerea)单孢菌株,用最低抑制浓度法(MIC)测定了其对苯并咪唑类(多菌灵)、二甲酰亚胺类(腐霉利)和氨基甲酸酯类(乙霉威)杀菌剂的抗药性。结果表明:番茄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威产生抗性菌株的频率分别为96.3%、80.7%和58.7%;所测菌株对3类杀菌剂的抗性类型有BenRDicSNPCS、BenSDicSNPCR、BenRDicRNPCS和BenRDicRNPCR4种,所占比例分别是19.3%、3.7%、21.1%和56.0%,表明北京地区番茄灰霉病菌对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和氨基甲酸酯类三类杀菌剂的抗药性严重,在生产中需慎用,应选择一些替代的新型杀菌剂和生物农药。

广西番茄灰霉病菌的多重抗药性检测

进行259个灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌株对多菌灵(carbendazim)、腐霉利(procymidone)和乙霉威(diethofencarb)的抗性检测,结果分为6种抗性类型:单抗多菌灵的类型(B^RN^SD^S)占36.3％,单抗乙霉威的类型(B^SN^RD^S)占24.7％,抗多菌灵和腐霉利的类型(B^RN^SD^R)占20.1％,抗多菌灵和乙霉威的类型(B^RN^RD^S)占6.9％,抗腐霉利和乙霉威的类型(B^SN^RD^R)占5.8％,同时抗3种药剂的类型(B^RN^RD^R)占6.2％。各地双抗或多抗菌株出现的频率分别为田阳73.9％,田东61.9％,武鸣30.1％,南宁8.7％,柳州2.6％。大多数多菌灵抗性菌株的抗性水平很高(EC_(50)>1000 mg·L^(-1)),大多数腐霉利抗性菌株的抗性水平较低(EC_(50)<10 mg·L^(-1)),而乙霉威抗性菌株中,双抗或多抗菌株的抗性水平较低(EC_(50)<5 mg·L^(-1));单抗菌株的抗性水平较高(25.1884 mg·L^(-1)<EC_(50)<119.9776 mg·L^(-1))。

嘧霉胺和乙霉威在大葱中的残留消解动态

建立了大葱中嘧霉胺和乙霉威残留的检测方法,并测定了嘧霉胺和乙霉威在春季大葱中的残留消解动态和最终残留量。大葱样品经乙腈提取,SAX/PSA固相萃取柱净化,气相色谱-质谱选择离子(GC/MS/SIM)检测。结果表明,建立的大葱中嘧霉胺和乙霉威残留量检测方法在0.001～0.1mg/kg和0.01～0.1mg/kg水平的平均添加回收率为97.8%～107.2%,相对标准偏差为2.7%～7.4%,嘧霉胺和乙霉威的检出限分别为0.0003和0.003mg/kg,方法的定量限分别为0.001和0.01mg/kg。田间残留试验结果表明,嘧霉胺和乙霉威在大葱中消解较快,半衰期分别为4.1和3.1d,药后14d消解率均达90%以上;26%嘧霉.乙霉威可湿性粉剂(嘧霉胺和乙霉威质量比为10∶16)按推荐高剂量1800g/hm2(嘧霉胺有效成分180g/hm2,乙霉威有效成分288g/hm2)和2倍剂量3600g/hm2对水喷雾2～3次,末次施药后7,14,21d,嘧霉胺在大葱中的最终残留量为0.007～0.560mg/kg,乙霉威在大葱中的最终残留量为ND～0.394mg/kg,均低于日本规定的最大残留限量(MRL)2.0和5.0mg/kg。

天津市茄子灰霉病菌的抗药性检测

从天津市茄子保护地中分离出１２２个茄子灰霉病菌株中，多菌灵的抗性菌占４１０％，且多为高抗菌株；多菌灵与乙霉威间表现负交互抗性关系；速克灵和扑海因的抗性菌比率为２７９％，均为低抗水平，ＥＣ５０为２３０１１２０３８１０μｇ／ｍＬ，两种药剂存在交互抗性；对多菌灵、速克灵、扑海因均有抗性的菌株占供试菌株的２７９％，均敏感的菌株占５９０％，对多菌灵有抗性而对速克灵和扑海因敏感的菌株只占１３１％。

10%乙霉威·腐霉利微粉剂在设施黄瓜上的沉积分布及残留消解动态

为探究10%乙霉威·腐霉利微粉剂(有效成分质量分数:5%乙霉威,5%腐霉利)在设施黄瓜上施用后的沉积分布特性及残留消解动态,采用PC-3A(S)型激光粉尘仪及粉尘取样片,分别研究了不同设施类型、不同温湿度及不同施药角度下,10%乙霉威·腐霉利微粉剂在设施黄瓜上的沉积分布情况;并于2017年和2018年,分别在北京市进行了该药剂在设施黄瓜叶片和果实中的残留及消解动态试验。结果表明:不同设施类型、不同温度条件下,10%乙霉威·腐霉利微粉剂的沉积分布特性无明显差异,且其有效成分分解率不受温度影响;不同湿度条件下,该微粉剂在黄瓜叶片上的沉积量不同,湿度越大沉积量越多。乙霉威和腐霉利在黄瓜叶片和果实中的消解动态均符合准一级动力学或一级动力学方程,2种药剂在叶片中的半衰期分别为3.2 d和3.0~3.2 d,在果实中的半衰期分别为4.0~4.3 d和3.1~3.8 d。采用10%乙霉威·腐霉利微粉剂,分别按100 g/hm2和150 g/hm2(1.5倍)剂量于黄瓜幼果期施药,最多施药3次,施药间隔期为7 d,距最后一次施药间隔7、10和14 d分别采样,乙霉威在黄瓜果实中的最大残留量为0.88 mg/kg,低于中国国家标准规定的其最大残留限量(MRL)值(5 mg/kg),腐霉利在黄瓜果实中的最大残留量为0.49 mg/kg,也低于其MRL值(2 mg/kg)。该研究结果可为10%乙霉威·腐霉利微粉剂在设施黄瓜上的安全使用提供数据支持。

灰霉病菌对多菌灵和乙霉威抗性研究

从１９９６年３～４月辽宁省主要蔬菜种植区采集的番茄、黄瓜灰霉病果上，分离得到２８２个灰葡萄孢霉（ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａＰｅｒｓ．）菌株，测定了其对多菌灵和乙霉威的敏感性。结果表明，８７．２％的菌株为抗性菌株（ＢｅｎＲ），１２．８％的菌株为敏感菌株（ＢｅｎＳ）。中抗（ＢｅｎＩＲ）和低抗（ＢｅｎＷＲ）菌株为优势菌株。抗性菌株与敏感菌株在生长速率、产孢能力及致病力等方面无明显差异。作为苯并咪唑杀菌剂负交互抗性药剂而开发的Ｎ－苯基氨基甲酸酯杀菌剂乙霉威，对ＢｅｎＨＲ菌株具有优良的抑制作用，但对ＢｅｎＷＲ，ＢｅｎＩＲ和ＢｅｎＳ菌株的抑制作用很小。由多菌灵和乙霉威复配而成的多菌灵可有效控制ＢｅｎＨＲ和ＢｅｎＳ菌株对黄瓜子叶的侵染，但不能控制ＢｅｎＷＲ和ＢｅｎＩＲ菌株的侵染。

山西省灰霉病菌对乙霉威的抗性监测

对分离到的188个灰霉病菌菌株[BotrytiscinereaPers.]进行了乙霉威的抗性监测。用MIC法测出乙霉威敏感菌株114个,抗性菌株74个,并测定了4地区的抗性频率。毒力测定结果显示:敏感菌株的平均EC50值为0 0085μg·mL-1,EC90值为0 2596μg·mL-1;抗性菌株的平均EC50值为1 5563μg·mL-1,EC90值为3 0512μg·mL-1;抗性菌株的抗性倍数为183 09倍。晋北、晋中、晋东南和晋南的抗性频率分别为0%、26 0%、51 6%和52 3%。从山西省四大地区抗性监测结果看,晋南和晋东南抗性较强,晋中和晋北则相对较弱。

黄瓜灰霉病菌对多菌灵、速克灵及乙霉威的抗性检测

为了明确山西省晋中地区黄瓜灰霉病菌对多菌灵、乙霉威及速克灵的抗性水平,运用组织分离法从太谷、祁县和平遥的罹病黄瓜上分离到30个灰霉病菌菌株(Botrytis cinerea Pers.),并用最低抑制浓度法(MIC)和菌落直径生长法分别测定了这30个菌株的抗性频率和抗性水平。结果表明,30个菌株对乙霉威、多菌灵和速克灵的抗性频率分别为70%,80%和90%;3种杀菌剂敏感菌株的平均EC50分别为0.036 9,0.057 4,0.269 2μg/mL;3种杀菌剂抗性菌株的平均抗性倍数分别为66.0倍、421.5倍和55.3倍。表明山西晋中地区黄瓜灰霉病菌对乙霉威和速克灵的抗性达到中抗,对多菌灵的抗性为高抗。建议在该地区生产中停止使用多菌灵,减少使用乙霉威和速克灵或与其他药剂混合使用。

几种杀菌剂防治番茄灰霉病的药效评价

针对当前研制的不同类型药剂,通过室内抑菌测定和田间小区试验,评价了25%菌思奇EC等6种杀菌剂对番茄灰霉病菌的抑制作用和防治效果。结果显示,25%菌思奇EC、施佳乐40%SC、20%乙霉威WP、速克灵50%WP、50%多菌灵WP和50%福美双WP对番茄灰霉病菌的EC50分别为0.27,3.21,0.99,4.14,169.49和12.59μg/mL,田间试验防效依次为85.32%,83.65%,79.95%,82.29%,75.32%和70.49%。

应用特异等位PCR快速鉴定灰霉病菌抗苯莱特与乙霉威菌株

根据灰霉病菌Botrytis cinerea对苯并咪唑类（苯莱特）及N－苯氨基甲酸酯类（乙霉威）杀菌剂的抗性与其β－微管蛋白的198和200位密码子的单碱基突变紧密相关的原理，建立了一种同时检测灰霉病菌对这两类杀菌剂抗性表型的特异等位聚合酶链式反应（ASP,Allele-specific Polymerase Chain Reaction）方法，即将突变的单碱基作为正引物的3'末端，与之对应的未突变的单碱基作为负引物的3'末端， 自行设计了LP4～LP8等五个等位点特异性引物，应用包括这五个引物在内的七组引物，对生测为BenSNPCR、BenHRNPCS和BenHRNPCR菌株进行了ASP扩增，结果表明：该方法可以检测出相应抗药表型的菌株，并能有效地检测田间灰霉病菌的抗药性，从而该方法克服了生物检测方法费时和准确性差等缺点。该方法还能鉴定出生测法确定为同一表型如BenHRNPCR 中的BenSNPCR异核菌丝，或灰霉病菌侵染寄主后所产生的回复突变，因此其方法的灵敏度极高，可应用于灰霉病菌抗药性分子生态学机理研究和田间抗性菌株的快速鉴定。由于未发现BenMRNPCR型菌株，其适用性有待进一步验证。

固相萃取-高效液相色谱法同时检测水样中戊唑醇、乙霉威、晴菌唑、精甲霜灵和扑草净5种农药残留

利用石墨烯固相萃取柱萃取、高效液相色谱分离紫外检测,建立了戊唑醇、乙霉威、晴菌唑、精甲霜灵和扑草净5种农药同时检测的方法。确定的优化条件为:洗脱剂为5mL二氯甲烷、样品溶液的pH=7.0,样品体积为200mL。在此条件下,扑草净、戊唑醇、乙霉威、晴菌唑和精甲霜灵在0.05～100μg/L浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.895～0.992;信噪比为3时,5种农药的检出限为1.2～5.2ng/L;方法的精密度为1.4%～4.6%。将本方法用于环境水样标准加入分析,相对回收率为80.5%～107.6%;相对标准偏差均小于5%。

杀菌剂乙霉威的合成方法研究

以邻苯二乙醚为主要原料,经混酸硝化后催化加氢还原,得中间体对氨基邻苯二乙醚,再与氯甲酸异丙酯缩合,得到乙霉威。结果表明,催化加氢还原的最佳条件:反应温度90℃,催化剂用量为反应物质量的3%,压力1.5 MPa,反应时间3 h;缩合反应的最佳条件:以三乙胺为缚酸剂,溶剂甲苯与反应物的质量比为2.1∶1,对氨基邻苯二乙醚与氯甲酸异丙酯的摩尔比为1∶1.3,反应时间0.5 h。在较佳的反应条件下,乙霉威的总收率≥80.38%,含量≥98%。

山西省黄瓜灰霉病菌对乙霉威的抗药性检测

为了明确山西主要蔬菜种植区黄瓜灰霉病菌对乙霉威的敏感性,采用组织分离法从罹病黄瓜上得到176株灰霉病菌菌株(Botrytis cinerea Pers.),并采用最低抑制浓度法(MIC)和菌落直径生长法分别测定了176株菌株的抗性频率和抗性水平。结果表明:来自8个市区的176株黄瓜灰霉病菌菌株对乙霉威的抗性频率为77.84%,平均抗性水平为312.1倍,其中,敏感菌株39株,低抗菌株46株,中抗菌株28株,高抗菌株50株,特高抗菌株13株。表明山西黄瓜灰霉病菌对乙霉威的抗性程度增强,建议在生产中减少乙霉威的使用或与其他药剂混合使用。

硒催化羰基化合成乙霉威的研究

以1,2-二乙氧基苯为起始原料,首先经硝化制得3,4-二乙氧基硝基苯。然后再以廉价易得的非金属硒作催化剂,一氧化碳作羰基化试剂,在优化条件下,经硒催化3,4-二乙氧基硝基苯与异丙醇的氧化还原羰基化反应可以65%的分离收率得到目标产物。与乙霉威的传统合成方法相比,该方法具有路线简短、操作简单、原子经济性高、成本低、环境相对友好等优点。

3,4-二乙氧基-5-乙基苯基氨基甲酸异丙酯的合成

以邻乙基苯酚为起始原料经醛基化、醚化、氧化、硝化、还原、缩合等过程合成了3,4-二乙氧基-5-乙基苯基氨基甲酸异丙酯,其结构经熔点、Mass和1H NMR确证。通过HPLC、紫光光谱和GCMass等手段证明3,4-二乙氧基-5-乙基苯基氨基甲酸异丙酯与乙霉威生产过程中产生的分子量为295的杂质为同一物质。

多菌灵与乙霉威复配对灰霉病的室内活性研究

采用盆栽喷雾法测试了多菌灵、乙霉威及其9个复配组合对番茄灰霉病多菌灵敏感菌和抗性菌的保护作用,并对2种单剂及其质量比1︰1的复配进行了治疗、淋雨及持效期试验。结果表明:多菌灵与乙霉威的9个配比均表现出相加或增效作用。当多菌灵与乙霉威配比为1︰1时,对敏感菌和抗性菌的共毒系数分别为739.84和460.63,增效作用最显著,且其治疗作用较强,药后10 h淋雨对药效影响小,持效期长达5 d。