重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ中残余DNA的检测

用地高辛标记工程菌DNA片断作探针 ,通过分子杂交和免疫显色检测重组天冬酰胺酶半成品中的残余DNA。该法对半成品用氯仿抽提 ,消除了蛋白质对DNA测定的干扰。 3批重组门冬酰胺酶半成品的测定结果表明 ,其残余DNA均小于 10 0 pg/剂量。

Pichia酵母宿主细胞DNA残留量检测方法的建立

为检测重组人血白蛋白中外源性DNA残留量,以宿主酵母工程菌基因组DNA为模板,使用地高辛标记探针进行点杂交.结果证明:该方法检测灵敏度较好,特异性较强,操作安全简便,可用于重组人血白蛋白的检测.

地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中的DNA残留量

为检测注射用重组双功能水蛭素半成品中的DNA残留量 ,应用地高辛标记重组双功能水蛭素工程菌DNA ,并以此为DNA探针进行点杂交 ,同时做特异性及灵敏度实验。结果证明 ,该方法检测最低限值可达1pg ,且重复性好 ,特异性强 ,操作较简便 。

地高辛标记探针检测重组人干扰素β_(1b)中DNA残留量

为检测注射用重组人干扰素β1b半成品中外源性DNA残留量,以重组人干扰素β1b工程菌基因组DNA为模板,用地高辛标记探针,并以此探针进行点杂交。结果证明,该方法检测灵敏度较好,特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素β1b制备过程中的质量监控及半成品的检定。

CHO宿主细胞DNA残留量检测方法的建立

目的建立检测生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的方法,制备检测CHO细胞DNA残留量的内部参考品,为国家相关标准的制定和修订提供依据。方法分别采用酚:氯仿:异戊醇抽提、DNA提取试剂盒和高盐抽提3种方法提取CHO细胞DNA,比较3种方法的提取效果;用地高辛标记最佳方法提取的CHO细胞DNA探针,并优化标记体系,直接法检测探针的标记效率;采用3种方法处理CHO细胞DNA内部参考品(1组不作处理;2组加入牛血清白蛋白和蛋白酶K;3组按2组方法处理后,增加DNA抽提步骤),通过点杂交法,用标记的探针检测上述样品的灵敏度。结果高盐抽提法提取的CHO细胞DNA效果较好;体系4(DNA10μg,Vial416μl,总体积64μl)标记效率最高;经不同方法处理的1、2、3组CHO细胞DNA内部参考品的检测灵敏度分别为1pg、10pg和1ng。结论建立的地高辛标记CHO细胞DNA探针-点杂交检测CHO细胞DNA残留量的方法稳定可靠,可用于生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的检测。

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源DNA残留量检测方法的建立

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主DNA残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组DNA,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组DNA超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA残留量进行测定。结果纯化后DNA样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp DNA超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞DNA残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。