谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1372bp,开放阅读框长1131bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66bp和175bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。

龙眼胚性愈伤组织肌动蛋白基因(actin)片段的克隆与序列分析

采用同源克隆方法从龙眼胚性愈伤组织分离肌动蛋白基因(actin)。通过保守区和3’RACE扩增,分别获得347bp和837bp的特异片段,经过序列拼接得到895bp的龙眼actin基因3’端序列。与多种植物的肌动蛋白基因进行同源性比较,该片段的核苷酸序列同源性多在80%以上,氨基酸序列同源性大于90%,具有高度保守性。可作为龙眼体胚发生过程中基因表达分析的内参。

能源植物续随子肌动蛋白Actin基因全长序列的克隆及序列分析

利用同源克隆和RACE技术克隆得到能源植物续随子肌动蛋白Actin基因的cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 743 bp(命名为ElActin,GenBank登录号为KC182753)。序列分析表明,ElActin开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5'非编码区247 bp,3'非编码区362 bp。ElActin与其他植物Actin基因的核苷酸序列同源性达到82%以上,氨基酸序列的同源性达97%以上。

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR研究DLCCoAOMT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT基因,GenBank登录号为JN093023。该cDNA全长993 bp,具有1个744 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT编码的氨基酸序列与其它植物的CCoAOMT蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼DLCCoAOMT与桦木属的CCoAOMT蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。

龙眼UGD6基因克隆及其表达特性分析

该试验采用RT-PCR和RACE技术,对龙眼多糖合成的关键基因尿苷二磷酸-葡萄糖6-脱氢酶基因(DlUGD6)进行分离克隆、生物信息学分析和亚细胞定位研究,并采用qRT-PCR技术,对其在龙眼体细胞胚胎发生、合子胚发育及不同组织器官中的表达模式进行分析。结果表明:(1)DlUGD6基因的cDNA序列全长1 860bp,包含开放阅读框1 443bp,编码480个氨基酸(GenBank登录号KU198438);生物信息学分析显示,DlUGD6属于稳定的酸性亲水蛋白,不含信号肽,具有跨膜结构和3个典型的保守结构域,属于UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脱氢酶家族;进化树分析表明,DlUGD6与柑橘亲缘关系较近。(2)洋葱内表皮GFP荧光定位观察发现,DlUGD6定位于细胞质;qRT-PCR结果显示,DlUGD6在龙眼非胚性愈伤组织中表达量相对较高,且在其他体胚发育阶段也均有稳定表达;在合子胚发育中子叶胚形成后第8天(S3)和第24天(S7)时表达量最高,整体呈"W"型;在不同组织器官中,DlUGD6在花药和茎中的表达量最高,且整体上生殖器官中的表达水平高于营养器官。研究认为,DlUGD6基因可能参与龙眼生长发育各个阶段中细胞壁多糖合成。

龙眼生长素应答因子基因克隆及其在体胚中的表达分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR结合RACE法克隆生长素应答因子基因(auxin response fac-tor,即DL-ARF1),运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR法研究其在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表达。结果表明:DL-ARF1基因的mRNA全长序列为2 695bp(GenBank登录号GQ923778),包含2 046bp开放阅读框,163bp 5′非编码区(5′UTR),486bp 3′非编码区(3′UTR);推定的氨基酸序列含681个氨基酸,与其它植物ARF基因相似性达40%～81%。DL-ARF1基因可能属于转录抑制因子,在龙眼体胚的各阶段均有表达,整个变化趋势呈双峰形,在胚性愈伤Ⅱ(Stage 2)中的表达量最高。

龙眼LEAFY同源基因片段的克隆和表达

研究克隆的龙眼(Dimdcarpus Longan Lour.)LFY同源基因(LLFY)保守区片段在不同组织器官以及“冲梢”逆转成的营养芽中的表达情况,为进一步鉴定龙眼LFY同源基因的功能及分析其在龙眼花序的“冲梢”过程中的作用机理奠定基础。根据不同物种LEAFY同源基因保守区序列设计简并引物,从“红核子”龙眼(D.longan Lour.cv.Red Seed)中克隆了425bp的cDNA片段。同源性比较结果表明,获得的序列为龙眼LEAFY同源基因(LLFY);同时还获得了1816bp的LLFY基因组序列片段并进行了序列分析。通过RT-PCR研究LLFY在6种龙眼不同组织器官的表达发现LLFY在花序芽和花芽中的表达量最高,叶芽中有微量表达,叶片和茎段中没有表达;在“冲梢”逆转成的营养芽中,LLFY的表达量明显高于叶芽。

龙眼胚性愈伤组织2个乙烯受体基因的克隆及序列分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到两个乙烯受体基因的cDNA序列,即DL-ETR1和DL-ERS1,并在GenBank登录(检索号分别为FJ513322和FJ513323)。DL-ETR1全长为2611bp,包含长2223bp的完整的开放阅读框(ORF)以及388bp的3-UTR,3'poly(A)尾长24bp;DL-ERS1全长为2259bp,包含一个1929bp的ORF及330bp的3-UTR,3'poly(A)尾长17bp。两者根据核苷酸序列推测的蛋白质具有61.62%的同源性,在N端的同源性较C端高,DL-ERS1比DL-ETR1少104个氨基酸,DL-ERS1的蛋白在C端缺乏信号接受域,HisKA、ATPase_c以及GAF是它们共有的结构域,同属ETR1亚类乙烯受体。

龙眼胚性愈伤组织LEC1基因cDNA克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达.克隆得到LEC1基因803 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU584089.2),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含222个氨基酸)与其他植物LEC1具有较高同源性;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,在心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈单峰型.

龙眼胚性愈伤组织fw2.2家族2个基因的克隆与分析

fruit weight 2.2(fw2.2)是植物中控制果实重量的重要数量性状的主效基因。以龙眼转录组数据库为基础,采用同源克隆法及RACE技术,从龙眼的胚性愈伤组织中获得fw2.2家族的2个cDNA全长序列,命名为Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-1,并对其核甘酸序列及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:Dlfw2.2-1基因的cDNA全长为970 bp,编码184个氨基酸;Dlfw2.2-2基因的cDNA全长为941 bp,编码175个氨基酸。Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-2的核甘酸序列及其推导的氨基酸序列与其它植物的fw2.2具有较高的同源性,亚细胞定位于细胞质膜,不含信号肽,具有跨膜结构与典型的与PLAC8同源的富半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich Protein)的保守结构域。植物中fw2.2系统进化树分析结果表明,Dlfw2.2-1和Dlfw2.2-2为同一分枝,与番茄和油梨的fw2.2的距离最近。因此,推测Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-2属于fw2.2基因家族的2个成员。

龙眼14-3-3基因及其启动子的克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织14-3-3基因,并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的cDNA全长序列和DNA序列,采用TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的启动子DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:经克隆得到龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因786 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU573765),该cDNA开放阅读框推定的氨基酸序列(含261个氨基酸)与其它植物14-3-3具有较高同源性;该基因的DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为1 859 bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因的启动子DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为910 bp;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,其中在松散型胚性愈伤组织阶段和心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈"倒S"状。

龙眼胚性愈伤组织ACC合成酶基因(DL-ACS1)的克隆及表达分析

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到龙眼胚性愈伤组织乙烯合成限速酶DL-ACS1(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,FJ617537),共1 817 bp,包含了5'非编码区(73 bp),开放阅读框(1 437 bp),3'非编码区(307 bp)。该cDNA开放阅读框的氨基酸序列(含478个氨基酸)与其它植物ACS具有77%～63%同源性,属于ACC Synthase家族。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)各阶段的表达量存在较大的时期差异,其中,球形胚(Stage 5)的表达量最高,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量最低。

龙眼体细胞胚胎发生研究进展

龙眼体胚发生系统是研究木本植物胚胎发生的优良体系,为研究龙眼体胚发生的分子调控机制和龙眼分子育种奠定基础。本文就龙眼胚性愈伤组织诱导与离体保存、高频体胚发生与植株再生、体胚同步化调控与组织形态学观察,体胚发生过程生理生化变化与代谢物积累、蛋白质组和全转录组测序分析、DNA甲基化研究,体胚发生相关基因克隆、全基因组鉴定及其表达模式与功能,以及遗传转化等相关研究进行综述,并对其研究前景进行展望。

龙眼DlIKU1基因的克隆与功能分析

拟南芥(Arabidopsis thaliana)IKU1基因突变可以产生较小的种子.根据植物IKU1同源基因的高度保守性,设计引物,PCR扩增获得龙眼(Dimocarpus longan Lour.)同源基因Dl IKU1的编码序列,其编码的蛋白含有VQ保守基序,与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性;由于龙眼遗传转化的限制,构建Dl IKU1基因的超量表达载体并转化拟南芥iku1突变体,统计转基因植株子代种子的长宽变化,结果表明:龙眼Dl IKU1基因的超量表达可以显著增加拟南芥种子的大小,说明龙眼Dl IKU1基因可以影响种子发育.上述结果为研究龙眼种子发育机理提供了理论和实验依据,有助于龙眼产业的发展.

龙眼体胚发生相关未知蛋白DlUP-3基因的克隆与表达分析

在龙眼体胚发生早期的蛋白质组学研究中,发现1个体胚发生相关未知蛋白DlUP-3,通过简并引物结合RACE技术进行其基因全长序列克隆。结果显示:(1)克隆到的龙眼体胚发生相关未知蛋白基因DlUP-3的全长cDNA序列为1 681bp,开放阅读框由1 017个核苷酸组成,编码338个氨基酸(GenBank登录号为GQ167202)。(2)生物信息学分析发现,该基因推导蛋白分子量为36 854.2Da,pI为9.05;该蛋白为Ras蛋白质家族成员,具有ATP/GTP-binding site motif A(P-loop)结合位点和1个典型的Ras_like_GTPase superfamily组件,无典型信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。(3)实时荧光定量PCR分析显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其中以胚性愈伤组织阶段表达量最低,而球形胚阶段最高。研究表明,DlUP-3基因在龙眼体胚发生过程尤其是球形胚阶段有重要的作用,为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础。

龙眼果实ACS和ACO基因克隆及其表达特性

采用RT-PCR和RACE扩增技术相结合的方法从龙眼果实中分离得到ACS和ACO基因,并分别命名为DlACS1和DlACO1。DlACS1蛋白一共编码486个氨基酸,含有7个保守区域和11个不变的氨基残基;DlACO1蛋白一共编码315个氨基酸,含有7个保守区域和9个不变的氨基残基。在龙眼果实发育过程中,果实乙烯释放量在幼果期出现一个小峰,随后逐渐降低,至发育后期维持在较低水平。Northern分析表明,果皮中DlACS1和DlACO1的表达均在果实快速生长期达到最高;在果肉中,DlACS1只在果肉生长初期表达,DlACO1表达随着果肉的生长缓慢降低,在果实成熟期略有升高。此外,DlACS1和DlACO1表达不具有组织特异性,但在各组织中的表达有明显差异。上述结果为研究非跃变型果实的成熟与乙烯之间的关系奠定了基础。

龙眼漆酶基因(DlLac)的克隆及表达分析

以‘石硖’龙眼为试材,采用RT-PCR结合RACE技术成功克隆一个龙眼漆酶基因全长c DNA序列,命名为Dl Lac,NCBI登录号为KY051551。Dl Lac基因序列全长1898 bp,编码576个氨基酸,NCBI比对结果显示其与荔枝漆酶氨基酸序列同源性最高,高达94%;进化树结果显示龙眼漆酶氨基酸序列与荔枝漆酶氨基酸序列具有高度同源性。氨基酸保守序列结果表明龙眼漆酶氨基酸序列含有漆酶的3个典型保守结构域,分别为:Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2。结合龙眼果实在常温、低温贮藏条件下,果皮褐变与Dl Lac的表达关系,推测Dl Lac的上调表达可能对龙眼果皮褐变起促进作用。

龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达

【目的】克隆龙眼Dimocarpus longan己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因,并对其进行生物信息学分析及原核表达分析.【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得基因全长c DNA序列,构建p ET-32a-Dl HXK原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中诱导表达.【结果和结论】成功克隆龙眼己糖激酶基因的c DNA全长序列,命名为Dl HXK,登录号为KF776906.1.龙眼Dl HXK序列全长2 101 bp,包括1个1 488 bp的开放阅读框,预测编码495个氨基酸;进化树和相似性分析发现,该基因与温州蜜柑Citrus unshiu的相似性最高,达到了82%;荧光定量表达分析表明,Dl HXK基因随着果实的发育成熟表达量逐渐上升;经IPTG诱导和SDSPAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白大小相吻合.由此可见,利用RT-PCR结合RACE方法成功克隆了龙眼的己糖激酶基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中获得高效表达.

龙眼中性转化酶基因(DlNI)的克隆及分析

【目的】中性转化酶是果实蔗糖代谢关键酶之一,克隆中性转化酶基因对于揭示龙眼果实糖代谢具有重要的意义。【方法】以‘石硖’龙眼试材,采用RT-PCR结合RACE技术成功克隆了3个龙眼中性转化酶基因全长cDNA序列。【结果】3个龙眼中性转化酶基因全长cDNA序列分别命名为DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3,NCBI登录号为KP769773、KP769774和KP769775,其中DlNI-1全长2090 bp,编码589个氨基酸,比对结果发现与木薯(82%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高;DlNI-2全长2558 bp,编码709个氨基酸,比对结果发现与克莱门柚(80%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高;DlNI-3全长2444 bp,编码805个氨基酸,比对结果发现与克莱门柚(80%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高。3个龙眼中性转化酶基因的氨基酸序列都具有中性转化酶的12个高度保守的结构域,并且都具有2个催化残基,推测其蛋白都属于α类,且都定位于细胞器中。3个基因在不同组织中表达量具有较大差异,其中DlNI-1和DlNI-2在叶片中都具有较高的表达量,而DlNI-3在果皮组织中具有最高的表达量。【结论】成功克隆了3个龙眼中性转化酶基因,为后期深入研究中性转化酶基因结构和功能奠定基础。