白喉毒素免疫毒素的研究进展

文章主要论述白喉毒素免疫毒素、白喉毒素免疫毒素的构造和效应、白喉毒素免疫毒素的不足、白喉毒素免疫毒素的开发应用、白喉毒素免疫毒素的发展前景。

重组白喉毒素活性的研究进展

为获得高活性、副作用小的重组白喉毒素,在免疫毒素药物ONTAK的基础上,从免疫毒素构建、纯化筛选、对动物及人类的活性研究方面出发,对近年来的重组白喉毒素的研究内容进行了汇总分析。重组白喉毒素的构建方式简捷,临床应用效果良好,通过动物实验可用于多种癌症的治疗,因此重组白喉毒素对肿瘤细胞具有靶向特异性、高效性的优点,是靶向治疗癌症的重要研究方向。

白喉毒素越膜机理研究进展

白喉毒素与细胞膜上的受体结合后,在受体个导的内吞作用下进入胞内体。综述了20世纪90年代后期至今,有关白喉毒素在胞内体的酸性环境中的特性研究。在酸性环境下,白喉毒素发生变构,T区疏水基团暴露并插入膜中,形成粘性孔道。T区形成的粘性孔道与白喉毒素结合,象分子伴侣一样,保持C区的线性结构,并使C区进入细胞膜。由于对白喉毒素作用机理的理解深入,逐渐产生一些新的应用前景。

提高免疫毒素DT_(386)-GMCSF在E.coli中表达量的研究

以人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体(GM-CSFR)为靶向的白喉毒素(DT)与GM-CSF免疫毒素DT386-GMCSF为急性髓系白血病提供了一种新的替代治疗途径,但该蛋白在E.coli中的表达量很低,难以进行工业化生产。为探索造成其低表达的关键影响因素,对DT386-GMCSF中的GM-CSF进行了C端的截短表达,发现GM-CSF中L114编码序列可明显影响融合蛋白的表达量。在此基础上,构建了一系列突变体,发现保留GM-CSF1-123位氨基酸且将L114L115V116突变为G114V115T116的突变体DF123GVT的表达量高于DT386-GMCSF,且对来源于高表达GM-CSF受体的HL60细胞的肿瘤单细胞具有相似的细胞毒作用。DF123GVT突变体的获得为GM-CSFR靶向的免疫毒素的开发应用打下了基础。

mM IP-1α-DT390重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达研究

目的构建小鼠M IP-1α(mM IP-1α)基因和白喉杆菌外毒素DT 390基因的真核融合表达载体,并对其功能进行初步研究。方法通过RT-PCR获得mM IP-1α基因,插入含DT 390基因的真核质粒SRα,获得真核表达载体SR-αmM IP-1-αDT 390。重组载体经PCR、限制性内切酶酶切及DNA序列测定鉴定,用Po lyF ect脂质体转染N IH 3T 3细胞,然后用免疫荧光技术检测目的蛋白的表达,并利用转染N IH 3T 3细胞后的培养上清体外测定mM IP-1-αDT 390融合蛋白的选择性细胞毒活性。结果成功构建真核表达质粒SR-αmM IP-1-αDT 390,mM IP-1-αDT 390融合蛋白可在N IH 3T 3细胞株中正确表达,细胞转染上清对小鼠活化T淋巴细胞具有较强的细胞抑制效应。结论mM IP-1-αDT 390融合基因真核表达载体的获得及功能的部分研究为进一步研究其抗炎效果和临床应用奠定基础。

重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。

抗HIV-1白喉免疫毒素的构建及原核表达

目的:构建重组DTA-hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法:通过PCR扩增,获得只含白喉毒素(DT)活性部位(DTA)的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS-PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA-hS120融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23%,表达形式主要为包涵体。结论:构建了DTA-hS120重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。

白喉毒素A片段的表达纯化与单克隆抗体制备

白喉毒素 (Diphtheriatoxin ,DT)A片段 (DTA)是白喉毒素的酶活性区 ,也是DT类免疫毒素的关键结构域。DTA蛋白及其单克隆抗体在免疫毒素的毒性机理、检测与纯化研究等方面具有重要价值。通过在E .coli中表达了DTA ,经Q SepharoseFF和Ni2 + Sepharose两步层析纯化 ,得到纯度约为 90 %的融合蛋白。以DTA为抗原免疫BalB c小鼠 ,获得了分泌抗DTA特异单抗的杂交瘤细胞株 3B6和 3B9。单抗为IgG1亚型 ,滴度达 1∶10 6 以上 ,与DTA的结合可被抗DT马血清竞争抑制。抗DTA单抗用于免疫印迹试验 ,或制备成免疫亲和柱纯化基于DT的重组免疫毒素 ,均获得较好效果 。

白喉毒素DT_(386)片段的表达纯化及细胞毒性研究

基于白喉毒素 (diphtheriatoxin ,DT)的免疫毒素在临床试验中普遍发现毒性反应 ,但机制尚不清楚。据推测 ,免疫毒素的细胞毒性源自DT的酶活性区和跨膜转运区 (N端 386～ 388个氨基酸 ,DT3 86)。为考察DT3 86毒素片段与毒性反应的关系 ,将DT3 86在E .coli中进行了表达、纯化 ,并初步观察了其细胞毒性。经Q SepharoseFF离子交换层析 ,获得纯度达 95 %的DT3 86蛋白。DT3 86杀伤HL60细胞的IC50 为 2× 1 0 -6mol L ,比免疫毒素的特异杀伤毒性低 1 0 0倍以上 ;但在高浓度下 ,DT3 86可非特异性杀伤多种细胞。小鼠体内实验初步结果表明 ,给药剂量高则体内毒性反应强烈。结果提示免疫毒素的剂量限制毒性与DT3 86的非特异细胞毒性有一定相关性 。

白喉毒素类免疫毒素研究进展

白喉毒素类免疫毒素是将缺失天然受体结合活性的白喉毒素片段或突变体与抗体或细胞因子偶联而得到的一类新型导向药物 ,它可特异性识别并结合靶细胞 ,通过发挥其ADP核糖基化活性而抑制细胞蛋白合成 ,引发细胞凋亡。由于白喉毒素类免疫毒素能高效、特异地杀伤特定靶细胞 ,而使其在肿瘤等疾病的药物开发中暂露头角。

白喉毒素氨基端389个氨基酸-人碱性成纤维细胞生长因子靶向毒素的克隆表达及对人品状体上皮细胞毒性研究

目的为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础。方法提取灭活的白喉杆菌DNA和12周胎脑皮质RNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端389个氨基酸(DT389)的基因片段及编码18 kd人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化鉴定表达产物,噻唑蓝(MTT)试验检测其对体外培养人品状体上皮细胞(HLECs)的毒性作用,流式细胞术鉴定不同剂量融合毒素所致HLZCs成活率及细胞死亡形式。结果扩增得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达;表达的融合蛋白对HLECs有明显的毒性作用并在一定范围内呈明显剂量依赖性,半数致死量为3．8×10-11mol／L,所致细胞死亡方式主要以凋亡为主。结论DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物促晶状体上皮细胞的凋亡、抑制后发障的研究奠定了物质基础。

构建靶向毒素血管内皮生长因子抗体-白喉毒素突变体

目的探讨以血管内皮生长因子(VEGF)抗体为导向,白喉毒素突变体(CRM9)作效应部分,构建靶向毒素VEGF抗体-CRM9,为直接杀伤肿瘤细胞寻找新的药物。方法应用异型双功能连接剂甲基丙烯酸甲酯丁二烯苯乙烯三元共聚物(MBS)连接兔抗人VEGF多抗和CRM9,制备成新的构建蛋白,Sephacryl S-300分离纯化后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明二者的结合情况。对构建蛋白抗体活性采用酶联免疫法检测,生物毒性应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测。结果构建蛋白通过分离并电泳后,出现明显增粗的分子量为116000新条带,位于CRM9和VEGF条带前方。构建的蛋白结合体中抗体活性检测,VEGF抗体与CRM9按1∶1制备的蛋白结合体,抗体活性与VEGF抗体对照差异无统计学意义(P>0·05),按1∶5和1∶8两种比例制备的蛋白结合体,抗体活性降低与VEGF抗体对照差异有统计学意义(P<0·01)。构建的蛋白结合体中CRM9毒性检测,VEGF与CRM9按1∶1比例制备蛋白结合体杀伤效果与空白对照组差异有统计学意义(P<0·01),与CRM9组差异无统计学意义(P>0·05),CRM9组杀伤效果与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0·01)。结论MBS能将VEGF抗体与CRM9连接构建成新的蛋白结合体,结合体中CRM9生物毒性和VEGF抗体活性不变。这将为进一步的免疫毒素抗肿瘤的各项研究奠定了基础。

亲和标记DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白的构建、表达及纯化

目的:构建含有亲和标记His-tag的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白,便于融合蛋白质的纯化。方法:利用含有His-tag序列、Factor Xa酶切识别序列、白喉毒素N端序列的基因作上游引物,含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2互补序列基因作下游引物,以pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EGF为模板,PCR扩增目的基因片段,并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a/亲和标记DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,融合蛋白在BL21(λDE3)中以可溶形式表达,通过硫酸铵盐析、亲和层析纯化、脱盐、Factor Xa酶切得到重组蛋白纯品。结果:扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的30.6%;纯化得到纯度为94.36%的重组蛋白。结论:成功构建了含有His-tag的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白,减少了纯化步骤,为进一步研究重组毒素、简便纯化途径奠定基础。

靶向PCSK9催化结构域的重组蛋白疫苗降胆固醇效果初步评价

PCSK9是机体内调节低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)代谢的重要蛋白之一,抑制PCSK9能够显著地降低血清LDL-C的水平。本研究的目的是构建靶向PCSK9的重组蛋白疫苗,为降低胆固醇疫苗药物的开发提供实验基础。本课题通过重叠PCR方法将白喉毒素跨膜结构和人PCSK9催化结构域基因串联,构建重组基因片段DTT-h PCSK9,在大肠杆菌中表达后经GST亲和纯化制备重组蛋白DTT-h PCSK9。用该蛋白免疫Balb/c小鼠后通过ELISA方法检测抗体应答水平,并测定小鼠体内胆固醇含量。结果显示,在小鼠体内DTT-h PCSK9引起了抗人PCSK9免疫反应,抗血清效价为1:10 000,并且该疫苗能够显著降低小鼠体内血清胆固醇含量(p<0.05)。

重组白喉毒素与血管内皮生长因子融合蛋白治疗裸鼠肿瘤模型的效果

目的构建重组白喉毒素(diphtheria toxin,DT)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)融合蛋白,研究其对裸鼠肿瘤模型的治疗效果。方法采用PCR扩增法从人外周血淋巴细胞cDNA中获取编码含8—110位氨基酸片段的VEGF_(8-110)基因,并从DT基因中扩增得到编码含1—384位氨基酸片段的DT_(384)基因,将目的基因克隆到质粒载体pET9a中,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21-Plys菌株表达重组蛋白,通过阴离子交换层析和分子筛层析纯化。将滴有融合蛋白的滤纸放到暴露的鸡胚绒毛尿囊膜上,孵育24 h后,观察融合蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜的影响。对接种肿瘤1周后的裸鼠进行尾静脉注射治疗,第21天处死裸鼠取下肿瘤,测量其体积和质量,观察融合蛋白对裸鼠肿瘤模型的治疗效果。结果重组质粒经测序鉴定构建正确。融合蛋白在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,包涵体具有高效的复性效果。DT_(384)-VEGF_(8-110)融合蛋白无法抑制鸡胚绒毛尿囊膜上的血管生长,DT_(384)-(VEGF_(8-110))_(2)融合蛋白可以抑制鸡胚绒毛尿囊膜上的血管生长,也可抑制裸鼠肿瘤生长。经DT_(384)-(VEGF_(8-110))_(2)融合蛋白治疗接种Bxpc3胰腺癌细胞的裸鼠,其肿瘤平均质量(t=5.908,P<0.001)和平均肿瘤体积(t=4.619,P<0.001)均小于对照组,且差异有统计学意义。结论DT_(384)-(VEGF_(8-110))_(2)融合蛋白能够有效抑制裸鼠肿瘤生长。