产气荚膜梭菌毒素疫苗研究进展

产气荚膜梭菌是一种引起人类和动物肠道感染和组织坏死的重要食源性病原体,致死因子是其产生的多种外毒素。合理使用抗菌药物及健康养殖需求的增加使疫苗预防更为重要。然而,传统的产气荚膜梭菌外毒素疫苗可能存在效果不稳定及残留毒素和甲醛等问题,引发了人们对这些疫苗安全性的担忧。该文系统介绍了产气荚膜梭菌的传统类毒素疫苗、基因工程重组疫苗及基于反向疫苗学和免疫信息学设计的表位肽疫苗最新研究进展,为研发制备有效、安全的新型产气荚膜梭菌毒素疫苗提供新思路。

G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及其免疫保护效果的评价

为研制G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,本研究将G型产气荚膜梭菌菌株(7a9-2、D3-2)增菌培养后接种产毒培养基高效产毒,除菌后获得外毒素,经粗提后进行SDS-PAGE检测。结果显示:制备的G型产气荚膜梭菌外毒素含有α、NetB两种毒素蛋白。将两株G型菌株所产外毒素经2倍倍比稀释后经腹腔注射小鼠,检测外毒素的致病性,结果显示7a9-2菌株所产外毒素毒力较强,可作为疫苗候选株。因此选择7a9-2菌株制备外毒素,并经甲醛灭活后制备G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,经检验合格后免疫三黄鸡。免疫后5周内,每周随机选取10只鸡采血分离血清,采用ELISA方法检测鸡血清中的抗体效价。结果显示,免疫组鸡血清稀释100倍后,一免组鸡的抗体效价最高可达6.83log2,二免组鸡抗体效价最高可达8.34log2,免疫后鸡体内可产生较高水平的抗G型产气荚膜梭菌的抗体。免疫后实验鸡通过口服鸡球虫卵囊和G型产气荚膜梭菌菌液进行攻毒试验,结果显示,攻毒后免疫组鸡肠道病变程度和发病率均显著低于对照组(P<0.05)。在整个实验过程中观察各组鸡的生长情况,计算鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G),以评估疫苗对鸡生长性能的影响。结果显示,免疫组鸡ADG显著高于对照组鸡(P<0.05),免疫组鸡与对照组鸡的ADFI无明显差异(P>0.05),免疫组鸡F/G显著低于对照组鸡(P<0.05)。上述结果首次表明,本研究制备的G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗免疫鸡后可显著降低由该菌引起的坏死性肠炎的发病率,且对鸡生长性能有显著提高作用。本研究制备的G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗为防控鸡的坏死性肠炎提供了可靠手段,且该疫苗具有良好的应用前景。

包裹破伤风类毒素蛋白的聚乳酸及聚乳酸/聚乙醇酸共聚微球的制备和体外释放特性

目的 探索包裹破伤风类毒素蛋白 (TT)的聚乳酸 (PLA)及聚乳酸 /聚乙醇酸 (PLG)共聚微球的制备及其体外释放特性。方法 采用溶剂蒸发技术 ,先以一种小分子量生物染料 伊文思蓝为包裹物模型 ,通过显微镜观察和比色分析探索微球的制备特性和最佳条件。在此基础上制备包裹TT的PLA和PLG微球。结果 微球的制备过程中存在着内水相蛋白朝外水相的流失 ,当聚合物浓度加大到 2 5 %～ 30 %时可使蛋白流失大大减少。包裹蛋白在微球中的分布与微球粒径的重量分布成正相关关系 ;随着微球粒径的增大 ,微球所载蛋白的体外释放高峰期延迟。结论 通过本模型条件可制备外观高质量的微球 。

嗜水气单胞菌HEC毒素苗对鲫鱼的免疫效果的初步研究

用嗜水气单胞菌强毒株BSK－10和TPS－30的HEC毒素苗分别免疫鲫鱼，以不同嗜水气单胞菌菌株攻毒，测定免疫保护率。结果显示：BSK－10HEC毒素苗对同型菌株攻击保护率达90％－100％，对异型菌株攻击的保护无效，为0－20％；TPS-30HEC毒素菌对同源菌株攻击的保护率达100％，对同型菌株的保护率为75.5％-100％，对异型菌株的保护率为44.4％-100％，经统计检验，TPS－30毒素苗对10株攻毒株的保护除1株无效外，其余均效果极显著或显著，对血清型不同的菌株的免疫保护率没有区别。

脉冲式破伤风类毒素聚乳酸微球动物免疫效果研究

目的 研究破伤风类毒素聚乳酸微球在动物体内的免疫效果及影响因素。方法 观察破伤风类毒素聚乳酸微球免疫动物后 1年中 ,动物血清抗体反应及免疫记忆反应的规律。结果 微球中抗原释放为脉冲式 ,释放时间与聚乳酸分子量、微球载药量及粒径有关 ,微球引起的抗体反应显著高于破伤风类毒素溶液一次免疫 ,与溶液 3次免疫效果相似。结论 创制了一种新型脉冲式释药系统 ,一次注射完成全程免疫 。

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。

腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系试验

为了确定腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系,将不同剂量的类毒素分别接种家兔和绵羊,免疫17日后测定血清中和效价,并用1MLD的毒素进行攻毒。测毒结果表明,1个家兔MLD的毒素含量为小鼠MLD的30倍,1个绵羊MLD的毒素含量为小鼠MLD的600倍。血清中和试验和免疫攻毒保护结果表明,类毒素含量与免疫效果在一定的范围内呈正相关,在家兔和绵羊上能提供保护的最小免疫剂量分别为100个小鼠MLD和300个小鼠MLD的类毒素。本试验结果为腐败梭菌疫苗的研制提供了重要的参考数据。

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。

魏氏梭菌毒素疫苗研制及其免疫家兔抗体消长规律

从山东省莱芜、泰安、潍坊等3个养兔场发生疑似梭菌性下痢的病兔体内分离到3株魏氏梭菌,鉴定为A型。利用该分离菌株和A型魏氏梭菌标准株(CVCC37)所产外毒素经甲醛灭活并加入氢氧化铝胶佐剂吸附浓缩后制备了A型魏氏梭菌类毒素疫苗。对该疫苗分别进行了安全性检验、有效免疫剂量试验和接种家兔1～23周血清中抗毒素(Ab)消长规律研究。结果表明,魏氏梭菌外毒素用0.3%甲醛32h能够彻底灭活,并最大可能地保持其抗原性;制备的魏氏梭菌类毒素疫苗无毒副作用,安全可靠;用野毒株和标准株制备的类毒素疫苗对家兔的有效免疫剂量为2mL/只,免疫保护效果可靠;采用野毒株和标准株制备的类毒素疫苗免疫接种家兔后第2周血清抗毒素效价迅速升高,到第4周达最高峰,分别为6.6log2和7.125log2,较高抗体滴度维持约17周后缓慢下降,至23周时血清平均抗毒素滴度仍维持在4.0log2和3.4log2以上,所以,该类毒素疫苗的免疫保护期可以设定为6个月。

东阳市流动人口新生儿破伤风疫情及其影响因素分析

目的 探索东阳市流动人口新生儿破伤风 (NNT)疫情的影响因素及防制措施。方法 采用描述流行病学方法 ,对东阳市 1999～ 2 0 0 3年NNT专报系统的监测资料和个案调查材料进行统计分析。结果 不安全接生、卫生知识缺乏、免疫预防意识差、对流动人口的生育管理不善是导致NNT发病的主要因素。结论 不安全接生 ,是NNT发病的主要因素。加强对流动人口的生育管理 ,加强对孕妇卫生知识的宣教 ,普及住院接生、消毒接生及新生儿脐带的无菌护理 ,动员和落实NNT高危险育龄期妇女接种破伤风类毒素 (TT) ,是目前预防和消除NNT的主要措施。

絮状试验用白喉和破伤风类毒素标准的国际协作试验

按照国际协作试验计划,本试验用 Ramon 絮状试验方法标化了絮状试验用白喉类毒素和破伤风类毒素国际标准各一批,推荐品即 DIFT 和 TEFT。本试验室标定结果与由13个实验室参加的国际协作标定结果几乎相同。以 DIFT 和 TEFT 为标准,用 Levine-Wyman 的试管絮状试验法和火箭电泳测定了几批白喉类毒素和破伤风类毒素的 Lf,其结果可与 Ramon 方法测定结果相比,证明火箭电泳可用于定量测定类毒素(或毒素)的絮状单位。

嗜水气单胞菌疫苗的研制

取致病性嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株接种改良肉汤，摇床培养１８０ｒｐｍ２８℃２４ｈ，用福尔马林灭活制得全菌苗。另将上述培养物离心，取上清经福尔马林灭活制得毒素苗。用全菌苗和毒素苗分别免疫小鼠，２周后强化免疫，而后用Ｊ－１株５０ＬＤ＿（５０）腹腔注射攻击，免疫组均保护，对照组全部死亡。在鲫鱼的免疫保护试验中，分别采用全菌苗及毒素亩作腹腔注射或浸泡免疫，４周后强化免疫。用ＡｈＪ－１株５０ＬＤ＿（５０）腹腔注射攻击。结果全菌苗注射组保护８７％（１３／１５）；毒素苗注射组保护４０％（８、２０）；全菌苗浸泡组保护４０％（６／１５）；毒素苗浸泡组保护６７％（１０／１５）；对照组全部死亡。免疫持续期试验表明，在两次免疫６个月后攻击，全菌苗或毒素苗均仍显示一定的保护力。在平均水温２７℃±２℃下，鲫鱼的抗体动态为：全菌苗注射免疫组在强化免疫后１周全菌凝集抗体达２￣６，此时可检测到鲫鱼体表粘液中有低滴度凝集抗体存在，较高滴度的血清凝集抗体至少可维持６个月。全菌苗浸泡组在强化免疫后约１０天血清中才出现凝集抗体，滴度较低。毒素苗注射免疫用的毒素溶血抑制抗体在初次免疫第２８天达２￣７，强化免疫后高滴度抗体可维持１７天；毒素苗浸泡组的?

绍兴市1999～2004年新生儿破伤风病例流行病学分析

目的了解绍兴市新生儿破伤风(NT)的流行病学特征,为控制和消除该病提供科学依据。方法用描述流行病学方法,对绍兴市1999～2004年NT专报系统的监测资料和个案调查材料进行统计分析。结果NT发病率波动在0.15‰～0.65‰之间,总体呈上升趋势,其中2004年有2个县(区)发病率≥1‰。NT病死率波动在11.11%～37.50%之间。病例主要集中在经济相对发达的越城区和绍兴县,发病无明显季节性。78例确诊病例中流动人口占89.74%,男性多于女性,男女性别比为2.12∶1,发病日龄集中在5～8d。在家分娩的占83.33%,接生员均未受过培训,所有母亲均无明确的破伤风类毒素(TT)接种史。结论旧法接生和产前未注射破伤风类毒素及人口流动是NT发病的主要因素。提高孕妇自我保健意识,推广住院分娩,对高危人群接种TT,加强新法接生培训,是消除NT的基本措施。

破伤风类毒素聚乳酸微球的体外释放研究及附加剂对药物释放的影响

目的 :研究破伤风类毒素聚乳酸微球 (TT MS)的体外释放规律 ,考察附加剂对药物释放的影响。方法 :破伤风类毒素聚乳酸微球体外释放试验进行了 84d ,测定释放量 ,考察 :(1)聚乳酸平均相对分子质量 ;(2 )微球载药量 ;(3)微球粒径 ;(4 )附加剂对药物释放的影响。结果 :破伤风类毒素聚乳酸微球体外释放有显著的长效作用 ,释放模型为零级释放 ,释放速度与前面提到的 4种影响因素直接相关。结论

魏氏梭菌类毒素疫苗研制及其免疫家兔抗体消长规律

本研究分别从山东省的莱芜、泰安、潍坊的三个养兔场发生疑似梭菌性下痢的病兔体分离到三株魏氏梭菌,鉴定为A型。利用该分离菌株和A型魏氏梭菌标准株(CVCC37)所产外毒素经甲醛灭活并加入氢氧化铝胶佐剂吸附浓缩后制备了A型魏氏梭菌类毒素疫苗。对该疫苗分别进行了安全性检验、有效免疫剂量试验和接种家兔1～23周血清中抗毒(素Ab)消长规律研究。结果表明,魏氏梭菌外毒素用0.3%甲醛32 h能够彻底灭活,并最大可能地保持其抗原性;制备的魏氏梭菌类毒素疫苗无毒副作用,安全可靠;用野毒株和标准株制备的类毒素疫苗对家兔的有效免疫剂量为2 mL/只,免疫保护效果可靠;采用野毒株和标准株制备的类毒素疫苗接种家兔后第二周血清抗毒素效价迅速升高,到第四周达最高峰,分别为6.6-和7.125 log2,较高抗体滴度维持约17周后缓慢下降,至23周时血清平均抗毒素滴度仍维持在4.0-和3.4 log2以上,所以,该类毒素疫苗的免疫保护期可以设定为6个月。

缓释破伤风类毒素微球的制备及其免疫原性

目的 用可生物降解缓释微球,单剂投递破伤风类毒毒。方法 用溶剂挥发法,将破伤风类毒素(TT)包入两种丙交酯-乙交酯共聚物制备成微球,用电镜观察微球的粒经与表面形态,用Bradford法及SDS-PAGE检测微球内蛋白含量及抗原结构的变化。TT微球免疫豚鼠后,观察抗体应答。结果 微球表面光滑,成球规律,两种微球平均粒径为8.4μm及9.7μm,包裹率为48％及56％,包裹后的TT结构未改变。TT微球免疫豚鼠后,1针诱导的抗TT-IgG及中和抗体滴度与3针铝吸附TT相似;TT微球免疫血清及铝吸附TT免疫血清与游离破伤风毒素有相似的结合特性。加强免疫后,TT微球的回忆应答优于铝佐剂疫苗。结论 可生物降解缓释微球单剂投递破伤风类毒素,可产生持续高的免疫应答。

表达LTB乳酸杆菌提高艰难梭菌类毒素疫苗黏膜免疫效应的研究

目的通过构建大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚单位(heat labile enterotoxin B subunit,LTB)乳酸杆菌表达载体,研究其对艰难梭菌类毒素疫苗的黏膜免疫保护效应。方法克隆LTB基因,制备pSIP411-LTB重组质粒,电转化到乳酸杆菌中,制备乳酸杆菌表达LTB载体;通过透析和层析等技术纯化艰难梭菌A毒素和B毒素,经甲醛处理获得的艰难梭菌A毒素和B毒素的类毒素作为疫苗候选抗原;在第0 d、第14 d和第28 d皮下接种小鼠艰难梭菌类毒素和口服乳酸杆菌表达LTB载体;在初次接种后第0 d、10 d、24 d和38 d检测抗A毒素和B毒素的血清IgG和粪便IgA;第34 d,小鼠经口感染艰难梭菌,观察疫苗保护效果。结果成功构建了LTB乳酸杆菌佐剂表达载体和制备了艰难梭菌A毒素和B毒素的内毒素;各疫苗组和疫苗+LTB佐剂组小鼠在感染艰难梭菌后,均无腹泻、体重减轻和死亡现象,而对照组老鼠腹泻发病率为100%,死亡率42.86%,5 d体重下降0.83 g;在初次接种后的10 d、24 d和38 d,与空白组比较,各疫苗组抗A毒素或B毒素的血清IgG及粪便IgA显著升高(F=284.93,1037.05,696.82,74,184.07,166.95,P<0.01);与疫苗组比较,接种疫苗+LTB佐剂组的血清IgG及粪便IgA显著升高(F=21.88,27.22,8.31,56.49,63.76,101.78,P<0.05)。结论艰难梭菌A毒素和B毒素的类毒素作为疫苗的候选抗原对艰难梭菌的感染具有很好的保护效应,LTB乳酸杆菌载体表达佐剂能够提高免疫动物的抗体效价,增强黏膜免疫效应。

单剂量破伤风类毒素微球在动物体内的药效

目的 :研究经破伤风类毒素聚乳酸微球免疫后的动物体内药效。方法 :测定破伤风类毒素聚乳酸微球免疫动物后 1年中动物血清抗体反应及疫苗制剂的生物利用度。结果 :单剂量聚乳酸微球制剂引起高水平的血清抗体效价 ,具有与疫苗常规的 3次免疫相似的药效。混合微球制剂的相对生物利用度为 1 0 7.0 9%。 1年后 3剂破伤风类毒素溶液引起的免疫记忆抗体效价为 5 .2× 1 0 6 ,而混合微球引起的免疫记忆抗体效价为 2 .6× 1 0 7。结论 :创制了单剂量疫苗制剂 ,一次注射完成全程免疫 。

D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的研制及保护效果的评价

为研制更有效的预防家畜D型产气荚膜梭菌肠毒血症的疫苗,本研究采用D型产气荚膜梭菌标准菌株增菌培养,经自制产毒培养基高效产毒,制备成D型产气荚膜梭菌氢氧化铝类毒素疫苗和白油类毒素疫苗。通过不同剂量疫苗免疫绵羊的攻毒保护试验和免疫绵羊的抗体水平监测,评估疫苗的免疫保护效果。结果表明:D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗安全性良好,氢氧化铝苗和白油苗对绵羊有效免疫剂量均为4 m L(外毒素对小鼠半数致死量为2-6.4/m L),绵羊接种一个有效免疫剂量后,氢氧化铝疫苗免疫保护周期为6周以上;白油疫苗免疫保护周期为21周以上。本研究结果表明两种疫苗均具有良好的应用前景。

百日咳、白喉、破伤风、乙型肝炎联合疫苗的实验研究

对制备无细胞百日咳菌苗、白喉、破伤风、乙型肝炎联合疫苗的实验室条件进行了初步探索，实验结果表明，联合疫苗的配方以每毫升无细胞百日咳组分１５－１８μｇ．ＰＮ、白喉类毒素３０ｌｆ、破伤风类毒素７－１０ｌｆ和基因工程乙肝表面抗原２０μｇ为宜，稀释缓冲液选用０．８５％ＮａＣｌ溶液吸附效果较好，动物实验证明联合疫苗中各组分均安全有效。