DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞及鉴定

目的研究DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察其体外生长特性,并采用免疫组织化学染色鉴定培养的上皮细胞。方法 DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察不同时期细胞的生长情况、细胞形态,做广谱角蛋白、MUC5AC免疫荧光染色及PAS染色鉴定;并比较不同部位结膜上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达阳性情况。结果 DispaseⅡ消化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,能传代4～5代;绝大多数细胞广谱角蛋白免疫荧光染色阳性,少数细胞MUC5AC表达阳性及PAS染色阳性。睑结膜、穹隆部结膜和球结膜细胞PCNA阳性率分别为:(32.14±1.69)%、(27.67±1.20)%、(22.76±1.73)%,兔睑结膜上皮细胞PCNA阳性率较穹隆部及球结膜上皮细胞的PCNA阳性率高,各部位PCNA阳性率间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的理想方法,兔眼睑结膜处可能存在结膜干细胞。

应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液获取高纯度基底细胞

目的 尝试应用DispaseⅡ分离酶获得含有完整基底细胞的表皮 ,再经淋巴细胞分层液收集活性强、生长快的基底细胞。探讨这样的细胞能否加快生长 ,缩短培养周期。方法 取植皮术后所剩中厚皮 ,经Dis paseⅡ处理后 ,用镊子分开表皮与真皮 ,表皮经胰酶进一步消化后 ,把细胞悬液通过淋巴细胞分层液将收集到的细胞作为实验组。以Tr法分离的表皮细胞作为对照组 ,两组间就细胞数、生长速度 ,克隆形成率与成膜时间进行比较。结果 所得数据经统计学处理显示 :实验组细胞的生长速度、克隆形成率与成膜时间比对照组明显加快。两组间有显著差异 (P <0 0 0 1)。结论 应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液能获得纯度高、活性强、增殖快的基底细胞。可以缩短培养周期 ,具有重要的临床意义。

Dispase Ⅱ分离皮肤表皮-真皮连接及光镜和扫描电镜样本的制作

ＤｉｓｐａｓｅⅡ分离皮肤表皮－真皮连接及光镜和扫描电镜样本的制作１姜笃银１陈璧２王剑波３史颖辉作者单位：１第四军医大学西京医院烧伤科，西安７１００３２２第四军医大学病理学教研室、３电镜中心，西安７１００３３复合皮（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｋｉｎ，ＣＳ）移...

Dispase Ⅱ和胰酶消化法分离大鼠皮肤角朊细胞的对比研究

引言国内外学者均用酶消化法分离表皮和真皮．消化酶有ＤｉｓｐａｓｅⅡ，胰酶和胶原酶，因胶原酶价钱昂贵，故多数单位不使用它．目前尚无学者对比研究ＤｉｓｐａｓｅⅡ和胰酶，观察其对收集的角朊细胞数、活力、细胞增殖及成纤维细胞（Ｆｂ）污染的影响，故我们希望通过...

酵素-Ⅱ分离人神经干细胞球

目的:寻找一种有效分离神经干细胞球并获得大量单个神经干细胞的方法。方法:取20周胎龄人胚胎脑组织分离单细胞,应用DMEM/F12培养基培养形成神经干细胞球,取神经干细胞球,分别以2.50g/L、1.25g/L胰蛋白酶及0.6u/ml、1.2u/ml、1.8u/ml、2.4u/ml酵素-Ⅱ(DispaseⅡ)消化,观察消化过程及细胞形态,对消化后的单个细胞进行培养,观察细胞生长情况,并进行免疫细胞化学染色鉴定。结果:各浓度Dispase-Ⅱ均能较完全地消化神经干细胞球,其中1.2u/ml、1.8u/mlDispase-Ⅱ消化后的细胞生长状况最佳。胰蛋白酶消化后细胞有较大的损伤,成活细胞少。消化后的细胞Nestin抗体染色结果(+),证实为神经干细胞。结论:一定浓度的DispaseⅡ消化神经干细胞球后,可获得大量成活单个神经干细胞。

兔无细胞真皮基质的研制

目的 探讨制备兔无细胞真皮基质(ADM)的最佳方法。 方法 选用三种不同的去表皮处理液,即高渗NaCl溶液、dispase Ⅱ分离酶和嗜热蛋白酶(thermolysin),结合去污剂0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)处理,分别制备兔ADM,并对其进行组织学检测。 结果 高渗NaCl-SDS制备的兔ADM尚有少量表皮残留,乳白色中夹杂浅黄色,组织学观察可见真皮中有较多细胞碎屑;而经dispase Ⅱ-SDS和thermolysin-SDS制备的兔ADM表皮完全去除,呈乳白色,组织学观察发现真皮中已不见任何细胞成分,胶原纤维排列规则。电镜观察,上述三种方法制备的兔ADM基底膜结构均完整。 结论 由dispase Ⅱ-SDS法和thermolysin-SDS法制备的兔ADM达到了完全去细胞化,符合制备要求。

不同消化酶对羊驼皮肤黑素细胞分离的影响

本研究旨在探讨羊驼皮肤黑素细胞的分离、培养及鉴定方法,为进一步研究色素沉积提供合适的细胞模型。取1～3岁的青年羊驼皮肤,用胰酶、胰酶∶EDTA、DispaseⅡ酶3种不同的消化酶消化羊驼皮肤,再用胰酶∶EDTA消化,分离得到羊驼黑素细胞,接种于多种促进黑素细胞生长的营养成分DMEM/F12培养基中,通过观察黑素细胞的生长、细胞接种数和细胞贴壁数检验黑素细胞的纯度。结果表明,DispaseⅡ组处理的羊驼皮肤,分离得到的黑素细胞明显多于其它2个组(P<0.01)。综上所述,选用DispaseⅡ酶作为分离羊驼皮肤的消化酶,可获得较纯的黑素细胞。

新生仔猪口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法

为了建立仔猪口腔黏膜上皮细胞（oral mucosal epithelial cells，OMEC）的体外培养方法，取新生仔猪的口腔颊膜组织，分别采用组织块培养法、胰蛋白酶消化法、DispaseⅡ和胰蛋白酶联合消化培养法、DispaseⅡ处理联合组织块培养法，对口腔黏膜上皮细胞进行原代和传代培养，用倒置显微镜观察培养细胞形态学特征及生长情况，对传代培养的OMEC，采用间接免疫荧光法检测广谱细胞角蛋白的表达情况，并进行透射电镜观察，用MTT法测定细胞的生长曲线，流式细胞仪检测其细胞周期。结果表明，在采用相同培养基条件下，采用组织块培养法、胰蛋白酶消化法不能成功培养仔猪OMEC，用DispaseⅡ和胰蛋白酶联合消化法培养的细胞不易贴壁，培养困难，采用DispaseⅡ处理联合组织块培养法培养的细胞增殖能力强，细胞纯度高，可连续传到10～11代，经鉴定具有OMEC特征。本试验成功建立了仔猪口腔黏膜上皮细胞的原代及传代培养方法，为进一步研究OMEC的永生化及猪口蹄疫致病机理和疫苗提供理想实验材料。

三种方法制作人脱细胞真皮基质的生物学特性比较

1材料与方法 1．1主要试剂 鼠抗人Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体，鼠抗人波形蛋白抗体，鼠抗人结蛋白抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；dispaseⅡ、Ⅰ型胶原酶、噻唑蓝（MTT）购白美国Sigma公司。

角质形成细胞与表皮干细胞双向电泳图谱差异分析

1材料与方法 1．1主要试剂与仪器 pH同相梯度干胶条（IPGstrip pH3～10，长17cm）购自广州威佳公司，dispaseⅡ、表皮干细胞（ESC）培养基、FBS和DMEM培养基购自美国Gibco公司，角蛋白19购自美国San-ta Cruz公司。等电聚焦仪、垂直电泳系统、

色素痣脱细胞真皮基质制备方法的实验研究

目的 通过对色素痣组织的脱细胞处理,制备一种能够避免异种和同种异体脱细胞真皮基质缺点的自体脱细胞真皮,为自体组织回植修复组织缺损提供实验依据.方法 将手术切除的1例患者的色素痣组织,切取2cm×2cm大小的色素痣25块,置于0.25% DispaseⅡ试剂中,室温下消化24h,去除表皮后,随机分成5个组,分别置于0.25%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%Triton X-100试剂中室温下消化.于不同的作用时间,取标本进行光镜、扫描电镜、透射电镜等检测.结果 色素痣组织在0.25%DispaseⅡ室温下作用24h,去除表皮,再分别用不同浓度的Triton X-100处理48～72h,可有效地去除色素痣组织中的痣细胞及其他所有细胞成分.光镜下胶原纤维粗细均匀,排列规整,无明显变性.扫描电镜观察可见起伏的皮肤纹理及天然毛孔结构,胶原纤维完整而连续,呈规律排列,相互交织成疏松立体网状结构.透射电镜观察胶原纤维粗细均匀,结构清晰,排列规整,可见细胞脱除后留下的腔隙,未见任何细胞碎片的残留.结论 用Triton X-100处理经DispaseⅡ消化去表皮的色素痣组织,当Triton X-100浓度超过0.5%以及Triton X-100作用时间超过48h,可有效地去除色素痣组织中的痣细胞及其他所有细胞成分,进一步增加Triton X-100浓度和脱细胞时间对脱细胞的效果无明显影响.

猪真皮脱细胞基质制备方法的实验研究

目的研究猪真皮脱细胞基质的制备方法。方法实验组使用0.125%胰蛋白酶和2.5 U/mL DispaseⅡ溶液,对照组使用PBS溶液,在4℃下,经过24 h脱去猪真皮细胞,配合0.5%SDS对脱细胞后基质振荡洗涤3 h和0.5%Triton X-100振荡洗涤24 h清除细胞碎片制备出猪真皮脱细胞基质。结果实验组制备的4种基质及对照组制备的2种基质进行病理切片,HE染色,显微镜下观察脱细胞效果。结论实验组制备的4种基质均符合脱细胞技术要求。