黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列克隆和报告基因载体活性分析

为深入研究黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列在性别决定与分化中细胞通路之间的转录调控作用。本研究以黄鳝基因组DNA为模板,PCR扩增出Dmrt1基因5′端侧翼序列,并对该序列进行了生物信息学分析,然后将克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列构建到PGL3-enhancer载体中,命名为pGL3-enhancer-Dmrt1,最后将pGL3-enhancer-Dmrt1和内参质粒pRL-TK共转染至HEK293细胞,采用双荧光素酶检测系统对Dmrt1基因5′端侧翼的启动活性进行了检测。实验结果显示:克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列为1519 bp;利用TESS-Transcription Element Search System转录因子结合位点在线预测数据库对黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列进行预测分析结果表明,该序列存在AP-1、Oct-1、C/EBPa和GATAx等真核生物通用的转录因子结合位点以及与性别相关基因的蛋白结合位点,如SRY、Sox3和Sox5等;双荧光素酶检测结果显示,该5′端侧翼序列具有启动活性。

Sqt-1的5'端侧翼序列在旋毛虫rol6基因中的启动功能验证

为验证秀丽隐杆线虫(C.elegans)sqt-1的5'端侧翼序列(5'-FSsqt-1)是否具有启动旋毛虫(T.spiralis)基因表达的功能,本研究采用PCR方法从C.elegans全基因组DNA中扩增5'-FSsqt-1,并将其克隆至以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的C.elegans启动子验证载体p PD95.77中,构建重组质粒p PD-sqt-GFP。将T.spiralis表皮胶原蛋白rol6编码序列克隆至5'-FSsqt-1下游,构建重组质粒p PD-sqt-rol6-GFP。通过显微注射法将p PD-sqt-GFP和p PD-sqt-rol6-GFP分别转入C.elegans体内,进行荧光观察及western blot鉴定。结果显示,T.spiralis表皮胶原蛋白Rol6能够在C.elegans体内获得表达。研究表明,5'-FSsqt-1具有启动T.spiralis基因表达的功能,为T.spiralis基因在C.elegans体内表达奠定了基础。