牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其在睾丸组织中的表达水平

【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt7基因cDNA序列一致,包含一个长度为1 113bp的开放阅读框,编码370个氨基酸,具有完整的DM功能域,二级结构主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主。在牦牛各组织器官中,Dmrt7基因mRNA仅在睾丸组织中特异性表达。牦牛睾丸组织中Dmrt7mRNA和蛋白的表达水平极显著高于犏牛(P<0.01)。【结论】牦牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA和蛋白表达水平明显高于犏牛,且Dmrt7蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。

牛Dmrt7基因cDNA的克隆和生物信息学分析

【目的】探讨牛Dmrt7基因的生物学功能,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。【方法】以牛睾丸组织为材料,根据GenBank中发表的小鼠Dmrt7基因序列,结合生物信息学技术,设计并合成2对引物,采用RT-PCR方法克隆牛Dmrt7 cDNA,并运用DNAMAN软件及在线工具对所得到的序列进行了生物信息学分析。采集牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、脾脏、瘤胃、子宫、小肠、心脏、卵巢和肌肉等11个组织,以牛-βactin基因为内参基因,对牛Dmrt7基因的组织表达谱进行分析。【结果】牛Dmrt7基因cDNA长度为1 378 bp(Genbank登录号为EF534775),包含由1 113个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF包含1个TAG终止密码子,编码370个氨基酸;在进化关系上,牛首先与狗聚为一类,亲缘关系最近,再与小鼠和大鼠聚为一类,最后与人和短尾猿聚为一类。Dmrt7蛋白含有一个DM结构域。牛Dmrt7基因在睾丸组织中高度表达,在其他组织中不表达。【结论】获得了牛Dmrt7基因的cDNA序列(Genband登录号为EF534775);牛Dmrt7蛋白可能对精液品质有影响。

牛Dmrt7基因的cDNA克隆及遗传变异

[目的]探讨牛Dmrt7基因的生物学功能及群体遗传变异情况,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。[方法]以牛睾丸组织为材料,根据GenBank上发表的小鼠的Dmrt7基因序列设计并合成2对引物,通过RT-PCR分别进行了扩增并运用DNA-MAN软件及在线工具对所得到的序列进行了生物信息学分析;同时,以牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、脾脏、瘤胃、子宫、小肠、心脏、卵巢和肌肉共11个组织为材料,另外设计2对引物用于组织表达谱分析。利用PCR-SSCP技术和DNA测序对Dmrt7基因的多态性进行检测。[结果]获得了一个长为1616bp的cDNA片段(GenBank登录号为EF534775),该cDNA包含由1113个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码370个氨基酸;发现在第四内含子上有一个C/G突变,随后在277头本地牛品种和国外牛品种中进行群体多态性检测,发现G等位基因频率分布范围从0～0.4138;基因杂合度,有效等位基因数和多态信息含量分别为0～0.4851、1.0000～1.9423和0～0.3675。[结论]克隆了牛Dmrt7基因的cDNA序列并进行组织表达谱分析,该G等位基因在本地牛品种和外国牛品种中没有差异。

Dmrt7基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

为了研究Dmrt7基因与GFP基因复制缺陷型腺病毒载体的构建,试验将购得的pReceiver-M01-Dmrt7质粒酶切、纯化后,与IRES-EGFP片段共同插到pShuttle-CMV载体中,经测序验证后,利用Adeasy-1系统细菌内同源重组原理构建Dmrt7基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-Dmrt7,再经PmeⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞,观察GFP表达并检测重组腺病毒的效价。结果表明:重组腺病毒载体Ad-Dmrt7经PacⅠ酶切得到23 kb和2.9 kb 2个特异性片段,表明同源重组成功;将此种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞24 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,表明Dmrt7重组腺病毒包装成功,效价为0.95×108pfu/mL。

Dmrt7在绵羊不同发育期睾丸组织中的表达与定位

探讨Double sex和mab-3相关转录因子7(Double sex and mab-3related transcription factor7,Dmrt7)在不同发育期绵羊睾丸组织中的表达规律和定位情况,本试验选取0、2、6、12和24月龄健康绵羊15只,每组3只,采集睾丸组织,运用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学染色方法检测不同月龄睾丸组织中Dmrt7的表达与定位情况。结果显示,在不同月龄绵羊睾丸组织中均检测到Dmrt7mRNA和蛋白,并且表达趋势较为一致,但不同月龄睾丸中表达量存在差异;在0、2和6月龄绵羊睾丸中,Dmrt7mRNA和蛋白表达量很低,而在12和24月龄表达量较高,并且极显著高于0、2和6月龄(P<0.01);0、2和6月龄绵羊睾丸组织中免疫阳性反应定位于少量的精原细胞,而在12和24月龄睾丸组织中免疫阳性反应主要定位于次级精母细胞和部分初级精母细胞及精子细胞。研究结果表明,Dmrt7可能对各级生精细胞的分裂过程尤其是初级精母细胞通过两次减数分裂形成精子细胞的过程起着重要的调控作用。