共表达分子伴侣蛋白提高III型普鲁兰水解酶在短小芽孢杆菌中的分泌表达及发酵优化

本研究旨在通过共表达分子伴侣蛋白以及优化发酵条件来提高III型普鲁兰水解酶(TK-PUL)在短小芽孢杆菌中的分泌表达水平。通过构建共表达TK-PUL和分子伴侣蛋白的多种重组短小芽孢杆菌,并以胞外酶活为指标对其进行筛选,确定最有利于TK-PUL分泌表达的分子伴侣蛋白及对应的重组短小芽孢杆菌。在此基础上采用单因素实验和响应面法优化重组短小芽孢杆菌的发酵条件。结果表明,共表达分子伴侣蛋白PrsA^(Ba)的重组短小芽孢杆菌的胞外酶活达到98.79 U/mL,提高了0.31倍。该重组短小芽孢杆菌的最佳培养基包括19.65 g/L葡萄糖、21.46 g/L酵母提取物、12.01 g/L MgCl_(2)·6H_(2)O、9.02 g/L脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H_(2)O、0.01 g/L MnSO4·4H_(2)O、0.001 g/L ZnSO4·7H_(2)O。在发酵温度为35℃、起始发酵pH为7.0的条件下,该重组短小芽孢杆菌于最佳培养基中培养66 h时,其胞外酶活达到192.68 U/mL,提高了1.56倍。本研究通过共表达分子伴侣蛋白和发酵优化实现了TK-PUL在短小芽孢杆菌的高效分泌表达,为TK-PUL的应用提供了基础。

甘蔗分子伴侣ShDnaJ基因克隆及在甘蔗线条花叶病毒胁迫下的表达分析

【目的】克隆甘蔗分子伴侣基因Sh DnaJ,并分析其在甘蔗线条花叶病毒(SCSMV)胁迫下的表达模式,为探究ShDnaJ基因在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】通过同源克隆技术克隆ShDnaJ基因完整开放阅读框(ORF)序列,利用生物信息学软件对其进行分析,再利用绿色荧光蛋白(GFP)融合表达法分析ShDnaJ蛋白的亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR检测ShDnaJ基因在甘蔗不同组织及在SCSMV胁迫下的表达水平。【结果】ShDnaJ基因ORF全长1260 bp,编码419个氨基酸残基,蛋白分子量为45682.47 Da,理论等电点(pI)为8.78,属于稳定的亲水蛋白,含有DnaJ结构域,属于DnaJ超家族成员,定位于内质网。ShDnaJ蛋白的二级结构由113个α-螺旋、31个β-转角、78个延伸链和197个无规则卷曲组成。ShDnaJ蛋白与高粱SbDnaJ蛋白的氨基酸序列相似性最高,为96.93%,说明两者亲缘关系最近。ShDnaJ基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,且根和茎中的相对表达量显著高于叶中(P<0.05,下同),但未成熟茎Sh DnaJ基因的相对表达量高于成熟茎;成熟叶ShDnaJ基因的相对表达量高于未成熟叶。随着处理时间的推移,SCSMV胁迫组和对照组(磷酸缓冲液处理)中ShDnaJ基因的相对表达量整体呈下降趋势,但SCSMV接种后不同时间点ShDnaJ基因的相对表达量均显著高于对照组。【结论】ShDnaJ基因具有组织表达特异性,且组织的成熟程度会影响其表达水平。SCSMV胁迫下该基因表达上调,推测该基因参与调控甘蔗植株对SCSMV的抗性。

基于分子伴侣蛋白信号通路探讨慢性应激大鼠海马神经可塑性损伤机制及逍遥散改善作用研究

目的:从分子伴侣蛋白信号通路角度出发,探讨慢性应激大鼠损伤海马神经可塑性的相关机制及疏肝解郁方药逍遥散的改善作用。方法:对慢性不可预知应激模型大鼠予逍遥散干预21 d,运用旷场试验和糖水消耗试验分别观察造模前后大鼠行为学指标。HE染色观察大鼠大脑海马形态学改变,同时ELISA测定血清皮质酮水平,PCR、Western blot法分析大鼠海马神经可塑性相关蛋白的mRNA与蛋白的表达,并进行统计分析。结果:逍遥散对慢性应激大鼠的干预疗效显著,如自由活动等行为学指标及大鼠海马组织病理学均得到显著改善(P<0.05),并能显著提高糖皮质激素受体(GR)、神经营养因子(BDNF)、分子伴侣蛋白4(FKBP4)的mRNA及蛋白表达,降低分子伴侣蛋白51(FKBP51)mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论:分子伴侣蛋白信号通路是慢性应激损伤大鼠海马神经可塑性的重要环节,也是逍遥散发挥抗应激损伤并修复受损海马神经可塑性的靶标之一。

人胃癌组织中分子伴侣蛋白的表达及检测

目的:检测人胃癌组织中GRP94/gp96,CRT的表达,分离并鉴定富含分子伴侣的细胞裂解物(CRCL),为研制和开发肿瘤来源的分子伴侣疫苗奠定基础.方法:采用免疫组织化学方法检测人胃癌组织中GRP94/gp96和CRT表达及其表达程度与胃癌病理因素的关系;等电聚焦技术从人胃癌组织匀浆中分离CRCL,经电泳及Westernblot进行蛋白分子质量及性质鉴定.结果:癌组织中GRP94/gp96和CRT表达的阳性率分别为86.3%和84.3%;而癌旁非癌组织中的阳性率分别为37.3%和43.1%,癌组织表达程度显著高于癌旁非癌组织(X2=25.946,18.704,P<0.01);癌组织中GRP94/gp96的表达程度与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关,CRT的表达程度与肿瘤大小及淋巴结转移有关.分离的CRCL经鉴定为HSP70,HSP90,GRP94/gp96,CRT.并且这些分子伴侣蛋白沿pH梯度集中分布于5-11号收集管中,其余管中未见明显表达.pH跨度为4.8-5.6.不同组织类型中分子伴侣蛋白的分布及pH跨度具有一致性.结论:胃癌组织中稳定表达GRP94/gp96和CRT,其表达程度与胃癌的发生、发展及其生物学行为有关.

分子伴侣HSP40/DNAJ蛋白家族及其在神经退行性疾病中的作用

分子伴侣和辅助伴侣分子能够促进新合成多肽的组装以及帮助未折叠或错误折叠的蛋白质重新折叠形成正确折叠的蛋白质,从而维持细胞内蛋白系统的稳态。作为热休克蛋白(HSP)70的辅助伴侣分子,HSP40(DNAJ)蛋白家族是目前已知的最大分子伴侣家族,能够通过J结构域与HSP70结合,从而帮助蛋白质折叠。近年研究发现,DNAJ家族蛋白与阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、进行性神经性腓骨肌萎缩症、脊髓性肌萎缩、远端型遗传性运动神经病变、肢带型肌营养不良、神经元蜡样质脂褐质沉积症和特发性震颤等神经退行性疾病的发生和发展有密切关系,如DNAJA1可有效降解亨廷顿蛋白聚集体;DNAJB1可降解蛋白聚集体ataxin-3;DNAJB2能够抑制亨廷顿蛋白聚集体的形成;DNAJB6能够抑制Aβ_(42)和α-突触核蛋白的聚集;DNAJC5可以促进TDP-43、τ蛋白和α-突触核蛋白释放到细胞外空间;与特发性震颤相关的DNAJC13的突变可能阻碍核内体蛋白运输。本文就DNAJ蛋白家族在神经退行性疾病中的作用机制进行综述。

DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究

目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,并以脂质体介导转染哺乳动物细胞,用免疫印迹及间接免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达。结果:筛选出全长pbp基因,经与GenBank中的序列比较分析证实,与DnaJ家族的1个成员-mrj(1.5 kb)的序列相同,且含140 bp左右富含GC的非编码区上游序列。在COS-7细胞 中瞬时表达的PBP,大多呈典型的胞浆分布,而J-domain缺失的pbp片段多为胞核分布。而在CHO细胞中稳定表达的PBP,在处于不同细胞周期时相的细胞中的分布不同。结论:DnaJ除与HSP70(DnaK)协同发挥重要功能外,其本身作为分子伴侣也可能发挥着重要作用,且与细胞周期可能存在某种密切联系。

用发光法测定DnaJ类分子伴侣MRJ对虫荧光素酶体外重折叠的促进作用(英文)

蛋白质的折叠使新翻译合成的多肽变成有生物功能的空间结构 ,因此蛋白质折叠是后基因组时代的重要工作。而在蛋白质折叠过程中 ,必须依靠分子伴侣的相互作用 ,才能保证蛋白质折叠向正确的方向进行。MRJ是一类新发现的DnaJ类分子伴侣 ,已证实它有调节ATP酶活性和阻止多聚谷氨酰胺凝聚的作用。我们用胍变性的虫荧光素酶作为蛋白质恢复功能活性的分子模型 ,用生物发光法研究了MRJ对蛋白质重新折叠的作用 ,发现MRJ确实有促进变性虫荧光素酶重新折叠并恢复其催化活力的功能。而且这种过程需要另一类Hsp6 0和Hsp70的协助 ,而这三种分子伴侣组合在一起 ,功效最好。实验中还发现 ,MRJ对虫荧光素酶恢复的促进作用是与ATP密切相关的。发光分析是研究分子伴侣促进蛋白质折叠过程的一种灵敏、精确和快速的技术手段。

辅助伴侣蛋白STUB1及其功能研究进展

STUB 1分子是一类新型的辅助性伴侣蛋白,在蛋白质折叠、组装、转运和降解中起着重要的调节作用,属于泛素连接酶。STUB 1具有E3泛素连接酶活性,能与Hsp70、Hsp90或者其它分子伴侣结合,促进底物的连接和链的延伸。STUB 1具有调控阿尔采末病、帕金森病、麦-考二氏综合征等神经退行性疾病相关的tau蛋白、Aβ、α-突触核蛋白、MKKS突变体等降解的作用;同时STUB1还受辅助伴侣蛋白HspBP1及细胞激酶Akt的调控。现将辅助伴侣蛋白STUB 1及其在不同疾病中的调节功能研究进展综述如下。

热休克蛋白70在心血管疾病中的研究进展

热休克蛋白70(Hsp70)是进化上高度保守的一种蛋白质,具有多种生物学功能,并在维持细胞稳态中发挥重要作用。病理条件下,Hsp70异常表达会影响心血管疾病的发生与进展。因此,本文对Hsp70结构、功能及其在2型长QT综合征、心肌缺血再灌注损伤、扩张型心肌病等疾病中的作用机制作一综述,并探讨可进一步深化研究的方向。

维持细胞内蛋白稳态的分枝杆菌伴侣蛋白:Cpn60.1和Cpn60.2介导的蛋白质折叠的分子伴侣功能

结核分枝杆菌编码的2种伴侣蛋白为MtbCpn60.1和MtbCpn60.2,它们与大肠埃希菌伴侣蛋白GroEL的序列具有显著的相似性。不同于GroEL,MtbCpn60.1和MtbCpn60.2是精炼过的低阶低聚物(lower-order oligomers)。先前有研究表明,MtbCpn60.2可以在大肠埃希菌中取代GroEL,但MtbCpn60.1的功能仍然是个谜。在文中,作者通过探索MtbCpn60.1和MtbCpn60.2在缺乏内源性GroEL的大肠埃希菌菌株中辅助专性伴侣蛋白DapA、FtsE和MetK折叠的能力,证明了它们的分子伴侣功能。研究发现,MtbCpn60.1和MtbCpn60.2都通过辅助DapA和FtsE的折叠来支持细胞存活和细胞分裂,但只有MtbCpn60.2能完全拯救GroEL耗尽的大肠埃希菌细胞。研究还发现,与MtbCpn60.2不同的是,MtbCpn60.1支持细胞生长和增殖以及协助MetK折叠的能力有限。研究表明,GroEL和MtbCpn60.2的折叠区有很大的重叠,而MtbCpn60.1只折叠GroEL折叠区的一小部分。因此得出的结论是,MtbCpn60.1和MtbCpn60.2之间的差异可能是由它们的固有序列特征所导致的,这些特征影响着它们的热稳定性、效率、折叠区和作用方式。

钙网蛋白通过内质网应激介导细胞凋亡的分子机制

钙网蛋白(Calreticulin,CRT)是46 kD大小的内质网管腔蛋白,具有分子伴侣活性、调节内钙稳态以及细胞凋亡等多种生物学功能。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程,早期反应是可逆的,但随着细胞损伤加重将会导致细胞的凋亡,即为内质网应激启动的细胞凋亡。新的研究显示,CRT在该凋亡途径中扮演着重要角色。从三方面综述两者间的相互关系,以期为该方向的研究人员提供一些参考。

DNAJ热休克蛋白家族成员B9的研究进展

DNAJ热休克蛋白家族成员B9(DNAJB9)是真核细胞内普遍存在的分子伴侣蛋白,参与调控真核生物的多种生理过程并发挥重要作用,包括调控内质网应激,协助蛋白质的翻译、折叠、组装、转运和降解,维持细胞稳态等。本文就DNAJB9的结构特征、生理功能及其在肿瘤、纤维性肾小球肾炎等疾病中的最新研究进展作一综述,为未来进一步探讨DNAJB9的作用和相关疾病的分子机制提供参考。

热休克蛋白47与消化系统肿瘤的研究进展

热休克蛋白47(HSP47)是由位于11q13.5染色体上的丝氨酸家族成员1基因所编码的一种蛋白质,是胶原正确折叠和分泌所必需的一种重要分子伴侣蛋白。HSP47在胶原合成的多个步骤中发挥至关重要的作用,可以防止前胶原聚集及诱导脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化。研究发现多种消化系统肿瘤中存在HSP47的异常表达,且HSP47可促进肿瘤血管生成、肿瘤增殖、迁移和转移。本综述拟重点探讨HSP47在消化系统肿瘤中的研究进展。

CHOP疗法对T细胞淋巴瘤Hut 78和HH细胞环状RNA circ＿001569及其下游蛋白表达的影响

目的探索CHOP疗法对T细胞淋巴瘤细胞中环状RNA circ_001569及其下游功能蛋白的影响。方法分别采用CHOP疗法中的4种化疗药物[环磷酰胺(1μmol/L)、羟基柔红霉素(0.2μmol/L)、长春新碱(1μmol/L)、泼尼松(1μmol/L)]处理T细胞淋巴瘤Hut78和HH细胞,以常规培养细胞作为对照。分组处理24 h后检测各组细胞增殖情况,采用特异性逆转录环状RNA和茎环法逆转录miRNA,实时定量PCR检测各组circRNA_001569、miR-145和BAG4 mRNA的表达水平,Western Blot检测BAG4蛋白表达。结果 4种药物均可显著抑制Hut78细胞和HH细胞增殖(P<0.05)。经过羟基柔红霉素、长春新碱处理后,Hut78和HH细胞circRNA_001569的表达水平降低,其下游分子miR-145表达上调,BAG4 mRNA和蛋白表达下调。结论 CHOP疗法治疗T细胞淋巴瘤的过程中,环状RNAcircRNA_001569可能起到了重要的调控作用。

肺炎克雷伯菌HdeA蛋白的抗酸理化性质鉴定

肺炎克雷伯菌是一种常见的院内条件致病菌,通常定植在人体的呼吸道和胃肠道。但肺炎克雷伯菌是怎样在胃液的强酸条件下存活并进入肠道尚不十分清楚。本研究发现,酸性条件能够诱导肺炎克雷伯菌Kp Hde A基因表达上调。克隆Kp Hde A基因并将其转化大肠杆菌,获得可溶性的Kp Hde A蛋白并利用镍离子亲和层析纯化得到目的蛋白。光散射分析证明,酸性胁迫下,Kp Hde A蛋白能够减少酸诱导的醇脱氢酶聚集。荧光实验证明,酸胁迫可以诱导Kp Hde A蛋白的疏水基团暴露。圆二色谱实验证明,酸性条件能够诱导Kp Hde A蛋白形成无序结构。此外Kp Hde A蛋白的表达能提高大肠杆菌的耐酸能力。故推测,Kp Hde A蛋白具有分子伴侣活性,并在肺炎克雷伯菌抵抗酸胁迫中起重要作用。

极端嗜热微生物分子伴侣蛋白研究与嗜热功能蛋白质的规模化制备技术研究

极端微生物是丰富的资源宝库,有着巨大的生物技术开发前景。本文从特殊功能蛋白质的发现与表征、结构与功能及潜在性应用,以及特殊功能蛋白质的规模化制备技术两个方面,对极端微生物的资源开发与利用进行了探讨。重点介绍了极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus分子伴侣蛋白系统的一些研究,并以P.furiosus胞外α-淀粉酶PFA为例,对工业生物技术领域重组蛋白质的规模化制备技术进行了讨论。

热应激蛋白与病毒免疫应答研究进展

热应激蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是生命体处于应激状态时机体为维护蛋白质正常生理功能而产生的一类伴侣蛋白。1962年,Ritossa最早发现了热应激反应[1],随后,Tissiere在该反应中成功分离到由基因转录增强而形成的蛋白质并将其命名为热应激蛋白(又名热休克蛋白)[2]。由于热应激蛋白种类繁多,迄今为止尚没有具体的分类标准,所以根据其分子量大小和主要功能,可将热应激蛋白大致分为几种不同的家族.

绵羊肺炎支原体内蒙古分离株DnaJ基因克隆表达及其免疫原性研究

[目的]克隆表达绵羊肺炎支原体DnaJ基因,研究其表达产物的免疫原性。[方法]以绵羊肺炎支原体内蒙古分离株NM03-MO株基因组DNA为模板,克隆其DnaJ基因序列,对蛋白质序列进行分析比对及三维结构预测;将该基因片段连接至pColdⅠ表达载体,构建pColdⅠ-DnaJ原核表达载体表达重组DnaJ蛋白并纯化,通过Western blot技术检测其与支原体抗体阳性血清的结合活性。[结果]NM03-MO株DnaJ蛋白序列与绵羊肺炎支原体序列同源性最高,但三维结构存在一定差异,重组DnaJ蛋白与绵羊肺炎支原体阳性血清有较好的结合活性,初步证明该蛋白具有免疫原性。[结论]绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白被首次成功克隆表达,且具有较好的免疫原性,为后续分子致病机制研究及新型疫苗研制奠定基础。

基因沉默伴侣蛋白CCT6A对甲状腺未分化癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨基因沉默伴侣蛋白CCT6A对甲状腺未分化癌细胞(8505C和CAL-62)增殖和侵袭能力的影响。方法:比较人新鲜甲状腺癌癌旁组织、甲状腺乳头状癌组织、甲状腺未分化癌组织中CCT6A mRNA相对表达量;选择两种人甲状腺未分化癌细胞株8505C和CAL-62,构建敲低CCT6A蛋白表达水平的细胞系,利用蛋白质印迹法验证转染效率后检测信号转导蛋白SMAD2的表达和活化。CCK8实验检测敲低CCT6A表达后甲状腺未分化癌细胞增殖能力的变化,Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果:甲状腺未分化癌组织中CCT6A的mRNA表达水平上调。敲低CCT6A的甲状腺未分化癌细胞8505C和CAL-62中信号转导蛋白SMAD2的磷酸化激活水平显著下调。与阴性对照组相比,基因沉默实验组的细胞增殖能力显著下降,其侵袭能力亦显著减弱(P<0.05)。结论:CCT6A在甲状腺未分化癌发生发展中起关键作用,敲低CCT6A可通过下调SMAD2活化水平抑制细胞增殖和侵袭能力,未来CCT6A可能成为治疗甲状腺未分化癌的潜在靶点。

Hsp40/DnaJ蛋白参与病毒复制与运动及相关抗病毒研究进展

病毒是细胞寄生生物,其生命周期需借助许多细胞蛋白才能得以完成。其中,细胞的伴侣蛋白在大多数病毒侵染及增殖过程中起重要作用。Hsp40/DnaJ家族蛋白属于分子伴侣蛋白一个大的亚群,其通过直接或招募Hsp70蛋白的方式,在病毒侵染和增殖过程中发挥重要作用。本文着重综述了目前Hsp40/DnaJ在病毒复制、病毒粒子在细胞间运动以及宿主抗病毒反应方面的研究进展,以期为开发针对Hsp40/DnaJ靶点的抗病毒药物或策略提供参考。