铁皮石斛DobHLH96基因克隆及表达分析

为了探究DobHLH96基因的生物学特性及其在响应逆境胁迫中的功能,利用同源克隆技术从广东丹霞铁皮石斛中克隆得到DobHLH96基因的cDNA全长序列。结果显示,DobHLH96开放阅读框全长为960 bp,编码319个氨基酸残基,理论相对分子量为31.2 ku,等电点为6.51,具有HLH结构域,符合bHLH结构特征。系统进化树结果显示,DobHLH96蛋白序列与鼓槌石斛中的氨基酸序列同源性最高。DobHLH96在铁皮石斛花器官中的相对表达量最高,具体的花组织排序为花蕾>花柱>萼片。分析结果显示,DobHLH96启动子元件具有与非生物胁迫、干旱、脱水、低温胁迫及脱落酸(ABA)响应等相关的顺式作用元件,而低温、干旱和ABA处理均能显著诱导DobHLH96基因的表达,并且在3种处理下该基因的表达模式基本一致,推测铁皮石斛的DobHLH96基因可能在转录水平上参与ABA介导的低温、干旱胁迫响应,可作为候选基因进一步研究其在抵御逆境胁迫中的调控功能。研究结果为深入研究DobHLH96基因的生物学功能提供了理论依据。

褪黑素诱导西伯利亚百合的转录组分析及LoERF96基因克隆

【目的】研究西伯利亚百合萌发阶段的分子调控机制,筛选响应褪黑素、促进百合鳞茎萌发的潜在乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)。【方法】对褪黑素处理下的西伯利亚百合小鳞茎关键时期样本进行转录组测序分析,并对差异表达基因进行功能注释,筛选响应褪黑素、促进百合鳞茎萌发的ERF潜在基因。对筛选的关键基因LoERF96进行克隆和生物信息学分析,通过实时荧光定量分析小鳞茎4个不同生长发育时期中LoERF96基因的表达量。【结果】根据转录组数据筛选得到780个差异表达基因,其中上调表达基因392个,下调表达基因388个。GO富集分析结果显示:富集的差异基因主要生物学过程包括代谢过程、细胞过程、生物调节、刺激响应、信号、生殖过程等。KEGG代谢途径分析结果显示:差异基因的代谢途径包括植物激素信号转导、植物MAPK信号途径、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、光合作用、碳代谢、内质网中的蛋白质加工等。通过同源克隆得到LoERF96基因,该基因序列全长435 bp,编码144个氨基酸,有1个AP2保守结构域,蛋白相对分子质量约为16.32 ku,理论等电点为4.94,是没有跨膜结构的亲水性蛋白,预测亚细胞定位于细胞核中。RT-qPCR表达结果显示:在百合4个不同生长发育过程中,LoERF96基因的相对表达量总体呈先上升后下降的趋势。【结论】西伯利亚百合中的乙烯响应因子LoERF96受褪黑素诱导表达,这一结果为探究百合AP2/ERF转录因子萌发阶段的生物学功能提供了理论基础和参考。

铁皮石斛DobHLH51 基因克隆及表达特性分析

bHLH转录因子(basic/helix-loop-helix)是植物响应非生物胁迫过程中重要的调控因子。为探究DobHLH51转录因子在铁皮石斛非生物胁迫响应中的表达调控机制,通过同源克隆从广东丹霞铁皮石斛叶组织中获得DobHLH51基因,并对其进行生物信息学及表达特性分析。结果显示,克隆的DobHLH51基因(Gen-Bank登录号OR234020)的CDS序列为768 bp,编码255个氨基酸,与参考序列(基因ID:LOC110107930)对比存在13个碱基差异。DobHLH51蛋白相对分子量为28.03 kDa,理论等电点为9.71,为亲水性不稳定蛋白,无信号肽和跨膜区域,含有52个磷酸化位点,具有bHLH保守结构域和ACT结构域。氨基酸序列分析表明DobHLH51与黄石斛(Dendrobium catenatum)和金钗石斛(Dendrobium nobile)的bHLH同源性最高。DobHLH51基因在广东丹霞铁皮石斛不同组织中的表达水平存在明显差异,在茎中的表达量最高。DobHLH51基因启动子序列含有多个非生物胁迫响应相关元件,且低温、干旱和ABA能够诱导DobHLH51基因显著表达。DobHLH51基因在低温和干旱胁迫下的表达模式基本一致,但其在ABA处理下的表达模式不同,推测该基因可能通过非依赖于ABA的信号转导途径参与低温和干旱胁迫响应过程。本研究结果可为后续进一步探究DobHLH51基因功能及其在非生物胁迫响应中的作用机制提供理论依据。

microRNA-96-5p靶向调控羊驼黑色素细胞中MITF基因的表达

旨在预测并验证调控小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)基因表达的关键miRNA。使用在线软件对与MITF具有靶向关系的miRNAs进行预测。在羊驼黑色素细胞中,利用荧光定量PCR检测过表达和抑制表达miR-96-5p后MITF基因的表达量;通过免疫细胞化学技术对过表达和抑制表达miR-96-5p的细胞进行MITF特异抗体的染色。结果表明,miR-96-5p是调控MITF表达的一个关键miRNA,经荧光定量PCR、免疫细胞化学技术检测,当过表达miR-96-5p后,MITF mRNA水平不变,但其下游基因表达量极显著降低(P<0.01),MITF蛋白水平表达量与其下游基因的蛋白水平表达量全部极显著低于空白组(P<0.01),当抑制表达miRNA-96-5p后,MITF mRNA水平不变,但其下游基因表达量显著升高(P<0.01),MITF蛋白水平表达量与其下游基因的蛋白水平表达量全部极显著高于空白组(P<0.01)。miR-96-5p可以靶向结合MITF基因,在MITF转录后水平发挥调控作用,抑制MITF的转录,抑制MITF及其下游基因TYR、TYRP1、TYRP2的表达。

禽流感病毒GD/1/96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达

从pUCM 1质粒中亚克隆禽流感病毒M基因至转移载体 pFastBac1质粒 ,PCR鉴定后 ,转化DH10 BAC感受态细胞。提取重组杆粒rBacM ,以M 13为通用引物作PCR分析 ,证明M基因已转入其中。用CellFectin试剂包裹rBacM杆粒转染sf9细胞 ,96h收取感染细胞。细胞表达产物裂解后作SDS PAGE蛋白电泳和Westernblot分析 ,证明M基因在昆虫细胞中成功表达且具有与天然M 1蛋白相似的活性。琼脂扩散试验结果进一步证明 ,重组M 1蛋白可作为诊断抗原。

肝癌基因谱动态表达及HSPgp96异常的临床价值

目的:探讨肝细胞癌变过程中基因表达谱的动态变化,观察热休克蛋白(HSP)gp96表达及其在肝癌早期诊断及判断预后方面的临床价值.方法:以2-乙酰氨基芴(2-FAA,0.05%)喂饲SD大鼠诱发肝癌发生,观察肝病理组织学(HE染色)改变,用全基因组芯片分析肝基因表达谱的动态变化,以巢式逆转录酶链反应扩增gp96基因片段.结果:SD大鼠在喂饲2-FAA后,肝细胞在诱癌早期发生颗粒样变性,中期出现不典型增生,后期见大量癌巢结节.肝癌发生过程中大鼠肝基因表达谱明显改变,与对照大鼠比较,癌变大鼠gp96上调3倍;诱癌变过程中,肝组织gp96 mRNA表达明显增加,变性组,癌前组和癌变组的肝组织中gp96基因表达均明显高于正常对照组(90.9%,100%,100%vs 16.67%,P<0.05).结论:肝细胞癌变过程中基因表达谱明显改变,其中gp96 mRNA呈过度表达,其分析有利于肝癌的诊断和预后判断.

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因克隆及序列分析

采用RT_PCR技术扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/ 3/ 96 (H5N1) (GD3/ 96 )NA基因 ,并对其进行了克隆与测序 ,该苷酸序列测定结果表明 :NA基因全长为 1410bp ,共编码 46 9个氨基酸。其序列与A/Hongkong/ 15 6 / 97(H5N1)、A/Chicken/HongKong/ 2 2 0 / 97(H5N1)、A/Goose/Guangdong/ 1/ 96 (H5N1)及A/teal/Hongkong/W312 / 97(H6N1)分离株核苷酸序列的同源性在88.4%～ 99.0 %之间 ,其相应氨基酸序列的同源性在 89.8%～ 99.2 %之间。氨基酸序列与香港流感分离株氨基酸序列相比 ,在茎部没有出现 19个氨基酸残基的缺失 。

慢病毒介导PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型建立

背景:第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是一种抑癌基因,可以通过调节PI3K/AKT/mTOR等信号通路在细胞增殖凋亡中起到作用。最新研究证实,PTEN可在脊髓损伤、周围神经缺损等骨科疾病中起到重要作用,而相关的细胞模型却鲜有报道。目的:构建携载大鼠PTEN基因的慢病毒载体,建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型。方法:设计大鼠PTEN基因RNAi序列,将其构建并包装成可转染的慢病毒,转染RSC96施万细胞后,通过RT-PCR检测RSC96施万细胞中PTEN基因的表达情况。结果:成功构建病毒滴度为8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒,将其转染RSC9施万细胞后,细胞中PTEN基因的相对表达量为0.2322±0.0187,敲减效率为76.78%,与阴性对照慢病毒转染组(1.0044±0.0022)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型,为研究PTEN基因相关的创伤骨科、脊柱外科、手外科疾病提供实验基础。

禽流感病毒新疆分离株1/96(H14N5)非结构蛋白基因克隆及序列分析

研究应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒分离株 A/ Chicken/ Xinjiang/ 1 / 96(H1 4 N5) ,提取病毒基因组及病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜细胞信使 RNA,运用 RT-PCR技术扩增病毒分离株的 NS1和 NS2基因 c DNA,克隆后进行序列测定。序列测定后分析结果表明 。

96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。

MiR-183/182/96基因簇在食管鳞癌组织中的表达变化及意义

目的观察miR-183/182/96基因簇在食管鳞癌组织中的表达变化并探讨其意义。方法取32例食管鳞癌组织、21例食管高级别上皮内瘤变组织、9例食管低级别上皮内瘤变组织,每例患者均取其病变组织及距病变组织5 cm外的正常食管组织各1份。采用Taq-Man qRT-PCR法检测组织中miR-183、miR-182、miR-96的表达。结果miR-183、miR-182在食管鳞癌及正常食管组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05),miR-183在食管高级别上皮内瘤变及正常食管组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05),而miR-182在食管高级别上皮内瘤变及正常食管组织中的表达差异无统计学意义,miR-183、miR-182在食管高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变组织间的表达差异无统计学意义,在食管低级别上皮内瘤变及正常食管组织中的表达差异无统计学意义;miR-96在食管鳞癌组织、食管高级别上皮内瘤变组织、食管低级别上皮内瘤变组织中的表达差异均无统计学意义。结论 miR-183/182/96基因簇中miR-183在食管鳞癌组织、食管高级别上皮内瘤变组织中的表达上调,检测miR-183/182/96基因簇表达有助于食管鳞癌的早期筛查。

COCH基因与miR-96的相关性研究

目的研究COCH基因与小分子RNAmiR-96的相互作用,探讨miR-96的表达变化是否对COCH基因有影响。方法在细胞水平上,转染miR-96的miRNA模拟物和miRNA抑制物而改变miR-96的表达水平,通过荧光定量PCR检测COCH基因的表达变化情况。结果 miR-96的表达变化与COCH基因的表达变化呈正相关关系。结论结果显示miR-96并没有对COCH基因进行负调控,而是呈现协同作用,甚至miR-96有可能作用于其他相关因子而导致COCH基因表达上调,从而影响COCH基因在耳蜗及前庭功能变化中的作用。

外源人gp96基因在肿瘤细胞中的高效表达

背景与目的:从肿瘤细胞中分离出的热休克蛋白gp96制备物免疫小鼠可产生抗相应肿瘤的特异性保护性细胞毒性T细胞免疫应答,为肿瘤免疫治疗开辟了一条新的可行性途径。但通常gp96在细胞中的表达水平较低,从有限的细胞或组织中获得的gp96制备物难以满足研究的需要。因此,本研究拟为制备高质量和充足的gp96而建立高表达gp96的单克隆细胞株。方法:构建人gp96cDNA的重组表达质粒pcDNA-hgp96并将其转染HeLa细胞,G418筛选稳定转染的阳性细胞克隆,然后用Western印迹分析单克隆细胞株的gp96表达量。结果:成功构建了人gp96的重组表达质粒,建立了稳定转染的单克隆细胞株,并筛选出一株高表达gp96的单克隆细胞。结论:成功建立了高表达gp96的单克隆细胞株,为gp96抗肿瘤免疫的研究奠定了基础。

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Westernblot鉴定抗体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37000;Westernblot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。

根癌农杆菌介导CMO基因在96-Ⅱ喜树中的遗传转化

利用根癌农杆菌介导法将抗旱基因——胆碱单加氧酶基因(CMO)转入到96-Ⅱ喜树体内,研究影响96-Ⅱ喜树遗传转化效率的因子,建立96-Ⅱ喜树遗传转化系统。结果表明:在遗传转化过程中,预培养3 d,将D600 nm为0.5的根癌农杆菌侵染叶片15 min,再共培养3 d,然后转入筛选培养基,有利于获得最高的遗传转化效率,经PCR和Southern blot检测,CMO基因已被整合到96-Ⅱ喜树的基因组中。

gp96-肽复合物体外对脾淋巴细胞基因表达及其抗肿瘤效应研究

目的:研究H22肿瘤细胞来源的gp96-多肽复合物体外对小鼠脾淋巴细胞TNF-α、IFN-γmRNA表达的影响;并观察其培养上清诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学变化。方法:利用蛋白提取纯化技术提取H22肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96,Western blotting法鉴定所得目的蛋白;RT-PCR法检测细胞TNF-α和IFN-γmRNA的表达水平;激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜观察细胞培养上清诱导H22肿瘤细胞的形态学变化。结果:经鉴定获得纯化的热休克蛋白gp96;gp96肽复合物诱导组的脾淋巴细胞TNF-α、IFN-γmRNA的表达强度(RV)分别为0.20±0.02及0.22±0.01,明显高于对照组的0.11±0.02、0.11±0.01和0.10±0.01、0.11±0.01(P<0.05);实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变。结论:H22肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能在体外增强小鼠脾淋巴细胞TNF-α、IFN-γmRNA的表达;同时,经诱导的脾细胞能分泌免疫活性物质诱导H22细胞凋亡。

miR-96靶向血管生成素-1基因对子宫内膜异位症子宫内膜干细胞增殖的影响

目的研究miR-96靶向血管生成素-1(Ang-1)基因对子宫内膜异位症(EM)子宫内膜干细胞(EnSCs)增殖的调控作用。方法分离培养EM患者EnSCs,流式细胞仪检测EnSCs表面标志物,RTPCR检测EnSCs中miR-96和Ang-1的表达,Western blot检测Ang-1蛋白表达水平,miR-96 inhibitor转染EnSCs后,RT-PCR和Western blot检测miR-96、Ang-1和蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测miR-96与Ang-1的相互作用,MTT细胞增殖实验检测miR-96对EnSCs增殖的影响。结果 EnSCs表达CD140b和CD146,不表达CD31和CD34; EM患者EnSCs中miR-96和Ang-1的表达均较非EM明显升高(P <0. 01),且两者的变化具有正相关性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs中miR-96和Ang-1表达降低;miR-96能与Ang-1的3'UTR特异性结合,调控Ang-1的表达活性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs的增殖能力下降。结论 miR-96通过靶向Ang-1促进EnSCs的增殖,可能在EM的发病过程中发挥作用。

噪声暴露人群的耳钙粘蛋白基因(CDH23)多态性、miR-96、miR-183基因变异性与听力损伤易感相关性

目的 探索噪声暴露人群的耳钙粘蛋白基因(CDH23)多态性、miR-96、miR-183基因变异性与听力损伤易感相关性。方法 回顾性分析的259例噪声暴露者均在2019年2月至2020年4月期间收集,根据纯音听力测试、听神经动作电位(CAP)、畸变产物耳声发射(DPOAE)测定结果分为两组,即听力损伤组89例,对照组170例,均进行CDH23、miR-96、miR-183基因检测,分析基因突变检测结果。结果 经二元Logistic回归分析,接触重金属、工龄>5年、高温接触、miR-96基因突变、CDH23基因突变、miR-183基因突变是导致听力受损的独立因子。经相关性分析,听力受损与重金属接触、粉尘接触、高温接触、工龄、CDH23基因、miR-96基因、miR-183基因呈正相关性。同时第七外显子(CDH23-Exon7)的末位CDH23-rs3802711位点基因型和等位基因时,存在统计差异(P<0.05)。结论噪声暴露人群听力损伤与miR-96基因、miR-183基因、CDH23基因多态性变异存在相关性。

小鼠热休克蛋白GP96基因真核表达载体的构建及其表达

目的构建小鼠热休克蛋白GP96（GP96）基因真核表达载体并在真核细胞293T中表达。方法用RT—PCR法从小鼠脾脏扩增出GP96的成熟肽基因片段，先克隆于pMD19-T载体，再亚克隆到真核表达载体peDNA3．1中。以脂质体法将重组质粒转入293T细胞，免疫印迹法鉴定GP96的蛋白表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明，扩增出GP96基因完全正确；免疫印迹法检测表明，转染的重组质粒能在293T细胞中高效表达。结论构建的pcDNA3．1-GP96重组载体在293T细胞系中高效表达，为深入研究GP96作为DNA疫苗在病毒性心肌炎中的作用及机制打下基础。

猫源C11orf96基因表达及其在细胞中的定位分析

本研究旨在通过克隆猫源C11orf96(Felis catus C11orf96,fC11orf96)基因,并制备其多克隆抗体分析该基因在细胞中的定位。以猫肾细胞cDNA为模板克隆fC11orf96基因,并利用无缝重组连接成功构建重组质粒pET-32a(+)-fC11orf96-Fe。随后将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达fC11orf96-Fe重组蛋白,并利用该重组蛋白制备多克隆抗体。最后利用Western blot及间接免疫荧光试验分析多克隆抗体的有效性及其细胞定位。结果表明,成功获得猫C11orf96基因CDS序列,全长372 bp,可编码124个氨基酸,表达的fC11orf96-Fe蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白大小约49 ku。由该重组蛋白制备的多克隆抗体能够识别细胞内源性fC11orf96蛋白和外源真核表达蛋白,并且发现fC11orf96蛋白定位于细胞质。本研究成功克隆得到猫C11orf96基因,并且fC11orf96蛋白定位于细胞质,为后续研究C11orf96的生物学功能奠定了基础。