多浪羊PROKR 2基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

【目的】克隆多浪羊促动力素受体2(prokineticin receptor 2,PROKR2)基因,并检测初情期启动过程中PROKR 2基因在多浪羊不同组织中的表达水平,为探究PROKR 2基因在绵羊初情期启动过程中的作用提供依据。【方法】以初情期后多浪羊下丘脑cDNA为模板,PCR扩增PROKR 2基因并克隆测序。利用DNAMAN软件对测序结果进行拼接,采用MegAlign软件进行物种间相似性比对并构建系统进化树,并利用生物信息学软件预测多浪羊PROKR2蛋白理化性质和结构功能。使用实时荧光定量PCR技术检测PROKR 2基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管及子宫中初情期前、初情期及初情期后的表达水平。【结果】克隆获得PROKR 2基因序列大小为2641 bp,包括5′-UTR 143 bp、3′-UTR 1343 bp和CDS区1155 bp,编码384个氨基酸,与GenBank中绵羊预测mRNA序列(登录号:XM_004014342.5)相似性为99.83%。系统进化树表明,多浪羊PROKR 2基因的遗传距离与山羊最近,与鸡最远。生物信息学分析表明,PROKR2蛋白为疏水稳定碱性蛋白,有7个跨膜结构,属于跨膜蛋白,存在31个磷酸化位点,主要在质膜上发挥作用。多浪羊PROKR2蛋白与GnRH1、PROK1、ANOS1等蛋白存在相互作用关系。实时荧光定量PCR结果显示,在多浪羊下丘脑各时期中PROKR 2基因表达量均显著高于其他组织(P<0.05),且在初情期后的表达量最高;垂体中PROKR 2基因表达量无显著变化(P>0.05);子宫中PROKR 2基因在初情期前的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05);卵巢和输卵管中PROKR 2基因在初情期的表达量显著高于初情期前和初情期后(P<0.05)。【结论】试验成功克隆了多浪羊PROKR 2基因CDS区序列,PROKR2蛋白属于疏水稳定碱性蛋白,含有7个跨膜结构,主要在下丘脑中表达,且在卵巢和输卵管中的总趋势为先升后降。研究结果可为进一步探究PROKR 2基因在绵羊初情期启动过程中的调控作用提供参考。

棉酚对多浪羊生长性能、营养物质表观消化率和棉酚代谢的影响

本试验旨在研究2种来源棉酚对多浪羊生长性能、营养物质表观消化率和棉酚代谢的影响。选取18只体重为(37.13±4.78)kg、安装永久性瘤胃瘘管的成年多浪羊毛用羯羊,随机分为3组,分别为对照组(CK组,不含棉酚的饲粮)、游离棉酚组(FG组,饲粮中游离棉酚含量为524.12 mg/kg)和醋酸棉酚组(AG组,饲粮中外源性醋酸棉酚添加量为524.12 mg/kg),每组6个重复,每个重复1只羊。试验期120 d。结果表明:1)与CK组相比,饲喂2种来源棉酚饲粮对多浪羊干物质采食量和平均日增重无显著影响(P>0.05),FG组料重比显著增加(P<0.05)。2)与CK组相比,饲喂2种来源棉酚饲粮显著降低了干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维表观消化率(P<0.05),FG组粗脂肪表观消化率显著增加(P=0.05)。3)与CK组相比,饲喂2种来源棉酚饲粮对饮水量、排尿量、尿蛋白含量和排粪量无显著影响(P>0.05),FG组尿液pH显著降低(P<0.05)。晨饲前瘤胃液游离棉酚含量低于晨饲后,且晨饲后瘤胃液游离棉酚含量呈先上升后下降的变化趋势,FG组瘤胃液游离棉酚含量达到最高峰时间晚于AG组。AG组血浆和尿液游离棉酚含量高于FG组,与粪便排出游离棉酚含量结果相反,FG组尿液游离棉酚含量显著低于AG组(P<0.05)。饲喂2种来源棉酚饲粮降低了多浪羊营养物质表观消化率,增加了瘤胃液、血浆、尿液和粪便游离棉酚含量,继而对多浪羊的生长性能和消化代谢造成一定影响。本研究建议实际生产中多浪羊饲粮中棉酚含量应低于524.12 mg/kg。

多浪羊NPTX 1基因克隆、生物信息学分析及在初情期的表达研究

【目的】试验旨在克隆多浪羊神经元正五聚体蛋白1(neuronal pentraxin 1,NPTX1)基因CDS序列,利用生物信息学分析NPTX1蛋白的结构和功能,并研究其在多浪羊初情期启动过程中性腺轴不同组织中的表达规律。【方法】采集初情期前、初情期、初情期后健康雌性多浪羊的下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫组织,提取总RNA并反转录成cDNA,以初情期前下丘脑cDNA为模板,PCR扩增多浪羊NPTX 1基因并克隆测序,对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析NPTX 1基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管5个组织中的表达水平。【结果】克隆得到NPTX 1基因长1576 bp,其中CDS区序列为1299 bp,与GenBank上预测的绵羊mRNA序列(登录号:XM_005683183.3)相似性达99.85%。系统进化树分析得出,多浪羊NPTX 1基因与绵羊的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析发现,NPTX1蛋白为不稳定的亲水性酸性蛋白,具有1个信号肽,属于分泌蛋白;二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比分别为41.90%和40.73%,与三级结构预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,NPTX 1基因在多浪羊3个时期5个不同性腺组织中均有表达,在初情期下丘脑中表达量最高,显著高于初情期前和初情期后(P<0.05)。【结论】试验成功克隆了多浪羊NPTX 1基因CDS全长序列,并揭示了NPTX 1基因在多浪羊初情期不同阶段性腺轴组织中的表达差异性,为进一步探究NPTX 1基因在多浪羊初情期启动过程中的调控机制提供依据。

多浪羊BMP7基因克隆、生物信息学分析及其在不同初情期阶段组织表达分析

【目的】对多浪羊骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP7)基因序列进行克隆和生物信息学分析,并检测多浪羊在初情期3个阶段5个组织中的表达规律,为探究BMP 7基因在多浪羊初情期中的生物学功能提供参考。【方法】采用PCR扩增多浪羊BMP 7基因序列并克隆测序,利用Mega 7.0软件构建系统发育树,利用生物信息学软件分析BMP7蛋白的理化性质和结构功能;采用实时荧光定量PCR检测BMP 7基因在初情期前、初情期、初情期后多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫5个组织中的表达量。【结果】试验成功获得多浪羊BMP 7基因序列长1334 bp,其中编码区长1296 bp,编码431个氨基酸,与绵羊和牛的亲缘关系最近,其次是人、猴、马,与小鼠和犬的亲缘关系最远。生物信息学分析显示,BMP7蛋白分子式为C_(2200)H_(3374)N_(632)O_(628)S_(17),理论等电点(pI)为8.17,原子总数为6851个,不稳定指数为53.18,脂溶性系数76.96,总平均亲水性为―0.419,为不稳定亲水碱性蛋白;二级结构主要以α-螺旋及无规则卷曲为主,三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR检测显示,BMP 7基因在多浪羊初情期前、初情期、初情期后均有表达,其中在下丘脑中表达量显著高于其他组织(P<0.05);在初情期前到初情期的下丘脑和子宫中BMP 7基因表达量显著上升(P<0.05),初情期到初情期后BMP 7基因表达量显著下降(P<0.05)。【结论】试验成功克隆了多浪羊BMP 7基因序列,该基因在多浪羊初情期前后3个不同阶段的5个组织中均有表达,结果为探究BMP 7基因在多浪羊初情期中的作用提供了参考。

多浪羊MHC-DQB1基因多态性与包虫病的抗性分析

目的探讨多浪羊MHC-DQB1基因多态性与包虫病的遗传抗性。方法采用PCR-RFLP方法,对101只包虫病(细粒棘球蚴病)阴性和64只阳性多浪羊MHC-DQB1第2外显子遗传多态性进行了检测,将包虫病阴性和阳性多浪羊的等位基因频率和基因型频率分别进行比较分析。结果多浪羊的MHC-DQB1基因外显子2在MroxⅠ、ScaⅠ、Sac1I、TaqⅠ、HaeIII和MvaⅠ酶切位点存在丰富的多态性,分别检测出2、2、3、2、3、6种等位基因,3、3、5、2、5、14种基因型。结论发现MvaⅠD(P<0.01)可能为多浪羊包虫病的抗性基因,MvaⅠDD和MvaⅠCD(P<0.05)疑似为多浪羊包虫病的抗性基因型,而MvaⅠBZ(P<0.05)与包虫病易感性相关。

多浪羊MHC-DRB1基因多态性与包虫病抗性分析

通过PCR扩增122只包虫病(细粒棘球蚴病)阴性和70只包虫病阳性多浪羊的MHC-DRB1第2外显子,产物经SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ3种限制性内切酶酶切后进行RFLP多态性分析。结果表明,多浪羊MHC-DRB1基因第2外显子在SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ酶切位点存在丰富的多态性,分别检测出了2、2和6种等位基因,出现了3、3和18种基因型。将包虫病阴性和阳性多浪羊的等位基因频率和基因型频率分别进行比较分析,发现等位基因HaeⅢa对包虫病感染具有一定的易感性(P<0.05),SacⅠab和Hin1Ⅰaa 2个基因型对包虫病具有一定的抗性(P<0.05),HaeⅢbe和HaeⅢef这2个基因型对包虫病具有较强的易感性(P<0.01)。

多浪羊MHC-DRB3基因座的PCR-RFLP多态性分析

主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个遗传区域,它在动物机体的免疫系统中发挥着非常重要的作用。应用PCR RFLP技术首次对多浪羊的MHC DRB3的外显子2进行分子遗传多态性检测与分析。结果显示,多浪羊MHC DRB3基因的外显子2在TaqⅠ、PstⅠ和HaeⅢ酶切位点存在多态,其酶切位点分别由2、2和6种共显性等位基因控制。综合3种酶切结果,本实验研究在多浪羊中检测到了DRB3基因的24种等位基因。

多浪羊MHC-DRB_1基因的HaeⅢ酶切多态性

应用巢式PCR-RFLP方法,对192只多浪羊的MHC-DRB1外显子2的遗传多态性进行检测,结果表明:多浪羊的MHC-DRB1基因外显子2在HaeⅢ的酶切位点存在多态性,这个酶切位点受6个等位基因控制,在多浪羊中共发现18种基因型;χ2适合性检验结果表明,多浪羊MHC-DRB1外显子2在HaeⅢ酶切位点未达到Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。

棉酚对多浪羊淋巴细胞凋亡的影响

通过棉酚对多浪羊淋巴细胞的研究,探索棉酚体积分数对淋巴细胞的影响.主要用细胞培养、瑞氏-吉姆萨染色、DNA电泳等方法观察棉酚对多浪羊淋巴细胞的凋亡效应.结果表明:当细胞培养液中棉酚体积分数为0.071mol/L,培养淋巴细胞8h后,可抑制多浪羊淋巴细胞的增殖,并且促进其凋亡.

布鲁氏菌活疫苗(M5)免疫试验——多浪羊抗体消长规律研究

为探究多浪羊布鲁氏菌活疫苗(M5)的免疫抗体消长规律,在新疆南疆地区某行政村,选择100只多浪羊进行皮下注射布鲁氏菌活疫苗(M5)免疫试验。免疫前,对所有试验羊只全部采血,分别于免疫后30、90、180 d,随机采集30只羊全血,分离血清,用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)进行布鲁氏菌抗体检测。结果显示:免疫前,所有试验羊只均未检测到抗体,免疫30 d后,73.33%的羊检测到抗体,90d后只有13.30%的羊还能检测到抗体,180 d后未检测到抗体。结果表明,布鲁氏菌活疫苗(M5)能够使多浪羊产生良好的免疫反应,免疫抗体持续期约为180 d。这说明对免疫180 d后的多浪羊进行布鲁氏菌抗体检测,可为区分自然感染和免疫提供参考。

应用E_2P_4浓度比判断雌性多浪绵羊和塔里木马鹿血浆P_4含量的波动

为了找出能够准确反映雌性哺乳动物体内血浆孕酮(P4)波动的检测方法,实验以多浪绵羊和塔里木马鹿为实验动物,分别对其发情周期各阶段的血液样本外周血雌二醇(E2),P4与促黄体生成素(LH)含量进行了放射免疫分析(RIA)测定。发现,应用E2 P4比值比传统的方法更能准确反映雌性哺乳动物体内血浆孕酮含量的波动情况。

萨福克羊、多浪羊和卡拉库尔羊杂交效果研究

本文对萨福克羊×多浪羊(简称萨多)杂种公羔羊和萨福克羊×卡拉库尔羊(简称萨卡)杂种公羔羊在相同舍饲条件下,同月龄羔羊的生长发育,产肉性能,屠宰性能等方面进行研究分析。结果表明:杂交一代羔羊体格粗壮,非常活波可爱、肉用体型具有明显的父本肉用体型特征,胸深宽,肋骨较开张,背宽,后躯较丰满,体形较宽、较长,生长快、毛色混杂等特点。萨多F1 7月龄羔羊的胴体重为20.7 kg,屠宰率为43.8%;萨卡F1 7月龄羔羊的胴体重为18.33 kg,屠宰率为42.7%。萨多F1 7月龄羔羊的胴体重比萨卡F17月龄羔羊的胴体重高2.4 kg,为萨卡F1公羔羊的1.1倍,增加12.6%;屠宰率高1.1%,为萨卡F1公羔羊的1.02倍;净肉率高1.84%,为萨卡F1公羔羊的1.02倍,差异极显著(P<0.01)。

多浪羊CNP基因克隆及其在初情期组织表达特性分析

【目的】克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】多浪羊CNP基因序列大小为2227 bp,其中包括5′-UTR 50 bp、3′-UTR 914 bp和CDS区1263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。

不同处理对多浪羊生殖激素及繁殖性能的影响

为研究不同营养水平的日粮和外源激素对多浪羊繁殖性能及血液生殖激素指标的影响,将78只多浪羊母羊按年龄、体重、胎次和断奶时间相近的原则随机分成3组:对照组为自然发情组;试验Ⅰ组为营养调控组;试验Ⅱ组为外源激素处理组。于试验开始第20天、配种后第10天,分别从各组随机抽取10只母羊空腹采血,测定6项血清生殖激素指标的含量。结果表明:使用外源激素PRID+PMSG+HCG后,FSH、LH、P4的水平均有升高,不但提高了母羊的发情率和产羔率,而且还达到产三羔的效果;日粮高能和添加维生素、矿物元素,可提高血清FSH、LH、P4的水平,从而使受胎率、产羔率、双羔率都有明显提高。

新疆多浪羊卵母细胞体外受精研究

动物胚胎体外生产技术为精卵受精、早期胚胎发育分化、早期胚胎性别控制机理等基础理论的研究及临床生产实践提供了重要的手段。虽然该技术在绵羊上的研究已经取得了许多进展,但目前其卵裂率、囊胚率仍然较低,尤其新疆多浪羊体外受精的研究更是不足。本试验以屠宰场多浪羊废弃卵巢为材料,通过卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育技术建立了南疆多浪羊早期胚胎体外生产技术体系,为新疆多浪羊高繁殖力的研究及繁殖潜能的发挥提供了材料及理论基础。

基于iTRAQ蛋白定量技术对多浪羊不同生理时期卵巢候选蛋白生物标志物的筛选

应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选多浪羊(Dolang sheep)发情期、发情间期和妊娠期差异表达蛋白质,为发情调控与鉴定、早期妊娠诊断等研究提供基础。通过iTRAQ并结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术,鉴定出4 845个蛋白,其中显著差异蛋白470个。与发情间期相比,发情期上调蛋白18个,下调蛋白102个,妊娠期上调蛋白20个,下调蛋白60个;与发情期相比,妊娠期上调蛋白50个,下调蛋白24个;上调蛋白中有cyclin-Y isoform X1,cleavages timulation factor subunit 1 isoform X1,follistatin-related protein 1 isoform X2,nicotinate phosphoribosyltransferase isoform X1,下调蛋白中hemopexin isoform X1,apolipoprotein A-Ⅱ,nucleophosmin等蛋白与激素生成、发情调控、合子的产生与凋亡、早期胚胎附植及胚胎发育等功能有关,其中相对于发情期和发情间情期,cyclin-Y isoform X1和nicotinate phosphoribosyltransferase isoform X1在妊娠期显著上调。试验通过i TRAQ蛋白质组学技术鉴定出的多浪羊发情及妊娠相关的差异蛋白质,为进一步探索绵羊发情鉴定和早期妊娠诊断候选生物标志物提供了新的思路和方法。