鸡朊样蛋白Doppel基因的克隆及其与PrP^C相互关系分析

克隆鸡Doppel蛋白(ChDpl)基因(PRND)并初步分析其与正常细胞型朊蛋白(PrPC)的相互关系,为禽源Dpl结构与功能、Dpl与PrPC互作关系机制的研究提供理论依据与分子基础;以多物种Dpl氨基酸序列为基础,通过比对找到Dpl氨基酸序列保守区,设计简并引物并依据鸡的密码子偏好性对引物进行优化,以逐步降低其简并性。用此特异性引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增鸡PRND基因,并将其克隆到pMD-18-T载体,鉴定后将序列上传GenBank数据库。结合Dpl与PrPC相关研究初步分析两者的相互关系;多物种Dpl氨基酸序列比对发现,第11—150位(139个氨基酸残基)为Dpl氨基酸序列保守区,以此区域设计引物并进行PCR扩增,得到约417bp的目的条带,GenBank登录号为KP140962。综合分析PrPC与Dpl相关研究发现,尽管Dpl与PrPC具有相似的翻译后修饰和空间结构,但两者多表现为拮抗作用,即PrPC能够拮抗Dpl的神经毒作用,尤其是其N-端包含八肽重复区的第23—88位残基对于保护Purkinje细胞免受Dpl诱导的神经退化作用至关重要。禽源Dpl的成功克隆不仅填补了目前研究的空白,更在分子水平为后续研究Dpl结构与功能及其与PrPC的拮抗机制奠定了基础。

Doppel蛋白研究进展

朊蛋白PrPC的错误折叠形式即PrPSc,它是瘙痒症感染因子的主要组成部分,也是可传播性海绵样脑病(TSE)的致病因子,但是PrPSc既不引发免疫应答也不产生炎症反应。编码细胞水平的PrPC蛋白的基因Prnp20年前就已经被克隆,但是其基因序列及功能仍不清楚。直到1999年才发现了一种新蛋白,命名为Doppel(Dpl),此蛋白与PrPC在生化和结构方面有不少相似性,其一级结构与PrPCC端的2/3有25%的同源性。尽管有关Dpl的研究尚处于萌芽状态,但它的发现已经解释了朊蛋白生物学上的一些谜团,而且对其生理功能也有了一定的了解。本文综述了近年来对Dop-pel蛋白的研究进展。

人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

目的体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白——截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较。方法通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态。结果两种蛋白均可在转染细胞中表达,并存在于细胞膜上;MTT结果显示,在转染24 h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞AnnexinV/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低。结论瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程。

重组人Doppel蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究

Doppel(Dpl)蛋白是新近发现的PrP相关蛋白。根据GenBank公布的人PRNDcDNA序列设计合成特异性引物,用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人PRND完整基因序列,测序正确后克隆至表达载体,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达重组人Doppel(rhDpl)蛋白。目的蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的60%以上。表达产物用Ni2+亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白,SDS-PAGE检测证实,纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD。Trypan Blue及MTT实验显示,在50μg/mL及以上剂量时,rhDpl蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用,在100μg/mL及以上剂量时,rhDpl具有杀伤HeLa细胞的活性,呈现明显的剂量和时间依赖性。Hoechst33342荧光染色观察显示经rhDpl作用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y呈现出细胞凋亡现象。这些结果提示Dpl蛋白具有体外细胞毒作用,并呈现明显的组织类型特异性。以上工作为进一步了解人Dpl蛋白体内外生物学作用奠定了基础。

缺失糖基磷脂酰肌醇锚的Doppel转基因小鼠的构建

将缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)的Doppel的质粒(pDoppel1-155),用NotⅠ酶切,回收并纯化目的基因片段,通过显微注射,导入BALB/c小鼠受精卵的雄原核内,结果32只仔鼠出生,其中有6只PCR检测阳性。将其中1只F0代小鼠与正常小鼠交配,共获得21只F1代小鼠,经PCR检测,有10只仔鼠为阳性。对2只F1代PCR阳性小鼠脑组织进行RT-PCR检测,其中1只为阳性。采集3只F1代PCR阳性小鼠脑组织进行Westernblotting检测,在小鼠脑组织能够表达17ku的Doppel1-155蛋白。本研究为进一步深入研究Doppel蛋白在体内的生物学特性提供了转基因动物模型。

朊蛋白(PrP)与叠朊(Doppel)蛋白相关性的研究进展

近几年研究发现,与传染性海绵状脑病(TSE)发生密切相关的朊蛋白基因Prn,包括三种基因:Prnp(PrP编码基因),Prnd(Doppel的编码基因)及Prnt.其中Prnd与Prnp关系更加密切.研究指出,二者的编码蛋白Doppel与PrPC的同源性虽然不高,但其翻译后修饰及空间结构却十分相似.这种相似性造成了二者在功能上的相关.如PrPC的缺失可能引起Doppel过表达;而PrPC也似乎能够拮抗Doppel引起的神经毒性.

Doppel蛋白的最新研究进展

Dpl是第一个经过鉴定的类朊蛋白。称为叠朊蛋白。对其分子结构、分布情况,生物学功能,已经有所了解。Dpl蛋白在Prp基因敲除小鼠(Prnp^(0/0)或Prnp^(-/-))表现出的神经毒性。以及在Prnd基因敲除小鼠表现出对雄性小鼠的可育性的重要性,使其具有很大的研究价值。本综述对Dpl的最新研究进展进行了总结,便于进一步研究工作的进行。

Doppel(叠朊蛋白)与Prion疾病

Doppel是近年发现的朊蛋白(PrP)类似蛋白,一级结构与PrPcC端的2/3有25％的同源性。一些PrP基因敲除的转基因小鼠由于Doppel高表达,引起神经细胞变性导致小鼠发生共济失调,从而推测Doppel可能与PrP一样在Prion疾病中发挥重要作用。

BALB/c小鼠Doppel蛋白的原核表达及其抗血清的制备

利用已克隆的BALB/c小鼠Doppel蛋白基因,将其成熟蛋白编码区亚克隆至表达载体pGEX-6P-1上,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-PRND。将重组蛋白表达载体转入E.coli BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果表明,BALB/c小鼠Doppel蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。对表达的蛋白进行提取和纯化并免疫新西兰大白兔制备兔抗血清,初步建立了小鼠睾丸Doppel蛋白组织学分布的免疫组织化学方法。为进一步研究Doppel的结构、功能及其在TSEs发生发展中的作用提供基础材料和数据。

pIRES2-EGFP-prnd真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

为探讨叠朊蛋白(Doppel)在正常生理条件及相关疾病中的临床及生物学意义,构建BALB/c小鼠Doppel基因prnd的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-prnd,并转染BHK细胞,IFA检测其表达情况。结果表明,Doppel蛋白通过pIRES2-EGFP-prnd在BHK细胞中表达。试验可为进一步研究Doppel蛋白的结构、正常的生理生化功能及其与相关疾病的关系提供重要工具。

人、牛和羊叠朊基因的表达及牛叠朊蛋白抗血清的制备

叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a(+)上,将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS-PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E.coli中获得了高效表达。用Ni-NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West-blot分析表明,制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应,却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。

牛叠朊编码基因缺失突变体的构建及在大肠杆菌中的表达

本实验室已制备出多株针对牛叠朊的单克隆抗体,为充分鉴定这些单克隆抗体针对的抗原表位,通过基因克隆表达的策略获取牛叠朊基因缺失突变体的重组蛋白,以期为单克隆抗体的表位鉴定提供物质材料。经过对牛成熟叠朊编码基因及预测蛋白结构特征的分析,设计表达9个缺失突变体的引物。以PCR扩增出叠朊基因的缺失突变体,与pET-30a(+)表达载体连接后转入E.coli DH5α中,经双酶切和测序鉴定后将重组质粒转入E.coliJM109和E.coli BL21表达宿主菌中,经IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达产物的相对分子质量、相对表达量和反应原性。结果表明,成功构建了9个牛叠朊编码基因的缺失突变体,通过IPTG的诱导表达,其中有6个缺失突变体被大肠杆菌高效表达,并且具有较好的反应原性,这为其单克隆抗体表位的进一步鉴定奠定了物质基础。