基于衍生化3-氨基-2-恶唑烷酮的夹心酶联免疫分析

建立一种3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)夹心免疫检测方法。通过1,6-己二醇连接2-硝基-4-羧基苯甲醛和生物素合成针对AOZ的新型衍生试剂。在样品前处理时加入衍生试剂可对AOZ进行衍生,衍生产率为89%。在酶标板上包被抗AOZ单克隆抗体并以辣根过氧化物酶标记的亲和素或抗生物素抗体作为第二结合物可实现AOZ的夹心酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)。从实际应用的角度,得到双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下两个表位的极限距离,分别为12Å和13Å,理想距离分别为16Å和17Å。在双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下的检出限分别达到1.8 pg/mL和0.8 pg/mL(以AOZ质量浓度计),相对于竞争ELISA,其灵敏度最高提高了25倍。平均回收率为73%~85%,平均相对标准偏差为9.0%。

内源性因素对抗体夹心免疫法检测血清心肌肌钙蛋白Ⅰ的干扰及解决方案研究进展

心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)是临床上诊断心肌损伤的首选血清学标志物。cTnⅠ检测基于抗体夹心免疫法,不同检测试剂中检测和捕获抗体所针对的cTnⅠ抗原表位不一致,易造成cTnⅠ检测结果的异质性。内源性干扰因素如cTnⅠ自身抗体、异嗜性抗体、类风湿因子等可严重的干扰cTnⅠ检测结果,影响临床上对心肌损伤类疾病的诊断、治疗及预后判断。该文就cTnⅠ的抗体夹心免疫检测和内源性因素对cTnⅠ检测的干扰及解决方案等方面研究进展作一综述,为临床上鉴别诊断cTnⅠ异常检测结果提供理论依据。

人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

抗体包被荧光免疫法测定水中的邻苯二甲酸二环己酯

用制备的邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）抗体包被酶标板，以酶联免疫双抗夹心法为基础，异硫氰酸荧光素为荧光探针，研究了双抗夹心免疫反应的条件，建立了邻苯二甲酸二环己酯抗体包被荧光免疫分析新方法，DCHP检出限是1．0×10^-4mg／L，线性范围为3．0×10^-4～0．1mg/L。该方法灵敏度高，选择性好，线性范围宽。

时间分辨荧光免疫分析及其在临床检测中的应用

本文介绍了时间分辨荧光免疫分析法的检测原理、检测方法 。

化学发光免疫法测定胰岛素的研究

作者以ABEI标记抗体,用双抗夹心法测定胰岛素含量,其固相化学发光采用 ABEI-CoCl_2-H_O_2体系,线性范围为每管0.3～150μU胰岛素,双对数回归方程的相关系数为0.985,绝对检测限为每管0.32μU胰岛素。

用光纤生物传感器检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌及葡萄球菌肠毒素B

目的:用新研制的光纤生物传感器FOB-3检测多种病原微生物及细菌毒素。方法:利用双抗体夹心法,优化免疫反应的时间和浓度后,用FOB-3分别检测炭疽芽孢及繁殖体、鼠疫F1抗原和葡萄球菌肠毒素B。为便于结果判定,确定截断(cutoff)值,并以Ssignal与Nnoise差值的形式消除荧光信号中的噪声。结果:使用光纤生物传感器FOB-3,在20min内可分别检测到50～1000ng/mL的鼠疫F1抗原、0.1～100μg/mL的葡萄球菌肠毒素B、3×101～3×106CFU/mL的炭疽杆菌繁殖体和4×104～4×107CFU/mL的炭疽芽孢。结论:光纤生物传感器可以灵敏、快速、便捷地检测病原微生物及其毒素。

C肽化学发光免疫诊断分析方法的建立及临床应用

目的：建立一种特异、敏感的临床C肽的化学发光免疫分析诊断方法并应用于临床。方法：采用特异性的两株C—P单克隆抗体，辣根过氧化物鲁米诺酶促增敏化学发光体系，利用双抗体夹心法检测。结果：敏感度为0．02μg／，L；检测线性范围为0．02～20μg／L；多人次检测证实试剂盒批内变异均小于10％，分析间变异小于15％；与18μg／L人胰岛素原、2000mIU／L的人胰岛素无显著交叉反应。结论：该方法灵敏度高，特异性好，稳定性强，检测范围宽，有良好的准确性和重复性，适合应用于临床。

一种检测血清心肌肌钙蛋白I的生物传感器

目的 :建立一种新的血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)定量检测法。方法 :用亲和层析法提纯cTnI,免疫BALB C鼠及新西兰兔 ,并用杂交瘤技术及膜渗滤亲和层析法 ,制备了特异性抗cTnI单克隆抗体和多克隆抗体。以葡萄球菌蛋白A作基底膜 ,特异性多克隆抗体作捕捉抗体 ,单抗 9F5作第二抗体 ,制成了表面等离子体共振生物传感器。比较了直接法和夹心免疫法检测血清cTnI的性能。结果 :夹心免疫法的最低检测限 (0 8μg L)是直接法的 5倍 (4 μg L) ,检测范围为 (0 8～ 2 0 ) μg L ,批内及批间精密度分别达 3 8%～ 5 1% ,6 3%～ 8 1%。用该夹心法及国外试剂盒分别检测 4 0名健康献血队员和 2 8例急性心肌梗死患者血清cTnI水平 ,两者符合率分别为 97 5 %和 94 6 %。结论 :所建立的夹心免疫法操作简单 ,特异性强 ,灵敏度高 ,符合临床诊断要求。

人骨钙素检测化学发光法的建立及性能评价

目的建立一种灵敏的定量检测人骨钙素的方法。方法采用磁微粒化学发光法定量检测人血清中的骨钙素含量,反应模式为双抗夹心法,生物素化捕获抗体,辣根过氧化物酶标记检测抗体与血清(校准品)及包被有链霉亲合素的磁微粒构成完整的分析系统。并对本方法进行条件优化、性能评估以及相关性分析。结果建立的人骨钙素磁微粒化学发光法线性范围为0.46～280.25 ng/mL,空白限为0.23 ng/mL,重复性和期间精密度(CV)分别小于8%和10%,回收试验回收率在103%～108%之间;血红蛋白、总胆红素和三酰甘油对骨钙素检测无干扰作用;在120例临床血清样本中,该方法检测骨钙素结果和罗氏电化学发光法结果相关系数(r)为0.992。结论建立的定量检测人骨钙素的磁微粒化学发光法精密度好、线性范围宽、灵敏度高,达到临床测定的需求。

中山市A组轮状病毒感染的流行病学特征

目的 了解中山地区A组轮状病毒感染情况和流行病学特征.方法 应用免疫层析双抗体夹心法对疑似A组轮状病毒感染的患儿新鲜粪便标本进行A组轮状病毒检测,并进行流行病学分析.结果 969例标本中168例A组轮状病毒抗原检测阳性,总阳性率为,17.34%,男女比例为2.23：1.00.6～12个月年龄段婴幼儿最为易感.在该地区秋冬季节是A组轮状病毒感染的高发季节,高峰在11～12月.结论 A组轮状病毒是中山地区婴幼儿腹泻的重要病原体,对A组轮状病毒进行监测对其诊断和合理治疗及流行情况的监控具有重大意义.

人β-hCG化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种检测人血清hCG浓度的双抗体夹心化学发光免疫分析方法。方法采用2种高特异性的抗β-hCC单克隆抗体，以一种包被微孔板制成固相抗体，另一种标记碱性磷酸酶，以金刚烷衍生物为底物，采用双抗体夹心法检测人血清hCG浓度，并与进口试剂进行比较。结果以5μg／ml单克隆抗体包被微孔板，酶结合物以1：10000稀释，在室温条件下检测，可测范围为5—540mIU／ml，灵敏度为0．143mIU／ml，批内、批间平均变异系数分别为5．28％和7．05％，平均回收率为98．77％，范围为92．3％．108．6％，与TSH、FSH和LH的交叉反应率均小于0．01％。与国外同类试剂有良好的相关性。结论该方法有较高的灵敏度、精密性和准确性。

基于硅纳米球探针构建的超灵敏电致化学发光免疫传感器用于丙肝核心抗原检测与临床诊断

目的:制备硅纳米球包裹的Ru(bpy)_3^(2+)(SiO_2@Ru)作为电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)探针的生物传感器,评价其在丙型肝炎核心抗原(HCVcAg)检测中的应用价值。方法:采用"油包水"的微乳剂方案,制备SiO_2@Ru纳米复合物,纳米粒子粒径一致,因此具有很好的重复性,应用戊二醛作为交联剂实现抗体与硅球的交联。SiO_2@Ru可作为ECL探针,通过夹心法检测HCVcAg。结果:HCVcAg检测的线性范围为1~1 000 fmol/L,最低检出限为3 fmol/L。与临床HCV RNA比较,有较好的相关性,线性相关系数R^2=0.937 9。结论 :构建HCVcAg的检测的硅纳米免疫传感器具有很高的灵敏度和很好的重复性,可用于临床诊断、疗效评价以及血液中心的血源筛查。

用多克隆抗体构建的夹心免疫传感器检测心肌肌钙蛋白I

用表面等离子体子共振生物传感器构建对心肌肌钙蛋白 I特异性的免疫传感器检测心肌肌钙蛋白 I,并建立两种检测方法 :直接法的最低检测限为 2 .5 μg/L,基于传感膜上的夹心免疫法的灵敏度为 0 .5 μg/L,检测范围为 0 .5～ 2 0 μg/L,批内及批间精密度分别为 3 .5 %～ 4.9% ,6.1 %～ 7.4% ;用夹心法及国外试剂盒对 40名健康献血者和 2 0例急性心肌梗死患者血清心肌肌钙蛋白 I水平进行检测 ,两者符合率为 95 % .

应用液相芯片检测空肠弯曲菌

[目的 ]建立空肠弯曲菌液相芯片检测方法。[方法 ]本研究将空肠弯曲菌HIP蛋白单克隆抗体与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立空肠弯曲菌液相芯片检测方法,测定不同浓度的抗体与微球偶联率。通过L9(34)正交设计试验优化方法的反应条件,并进行灵敏度和特异性试验。[结果 ]较优实验条件即多克隆抗体工作浓度为1:100、生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500、SA-PE的工作浓度为10ug/mL、生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为90min。该方法灵敏度可达103CFU/mL,与其他常见食源性致病菌无交叉反应。[结论 ]该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可快速检测食品中的空肠弯曲菌。

夹心法免疫层析试条的数学模型与仿真研究

基于夹心法免疫层析试条检测原理,结合对流扩散方程和流体动力学方程,建立了夹心法免疫层析试条动态反应过程的数学模型,并通过COMSOL软件对试条动态反应过程进行仿真。分别探究了目标待测物A浓度在0~20 mol/L,标记物P浓度在1×10!2~1×103mol/L以及硝酸纤维素膜的孔隙率在0~1范围内变化时,检测线上夹心复合物浓度关于位置和时间的浓度变化情况,并分析了各物质初始浓度以及试条结构对于检测结果和检测时间的影响。结果表明,在一定浓度范围内,目标待测物A以及标记物P浓度的增加将提高试条的定量检测性能,而孔隙率通过影响混合液流速和混合液中各物质反应接触情况来影响检测结果。

不同年龄段健康儿童血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)临床评估

目的比较不同年龄段健康儿童血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性和质量差异,并对其临床合理应用进行探讨。方法选取184例健康儿童,按年龄阶段进行分组,同时选取30例健康成人设为对照组,分别采用酶免疫抑制法测定血清CK-MB活性,双抗体夹心法测定血清CK-MB质量。结果各健康儿童组和成人组CK-MB活性和质量呈明显正相关;儿童组CK-MB活性和质量随年龄增长呈下降趋势,趋近成人水平;各组质量检测均在正常参考范围,而低年龄儿童组CK-MB活性略高于临床正常值。结论临床医生在参考CK-MB活性和质量检测结果进行病情判断时,要考虑年龄因素;在临床诊断中CK-MB质量测定更优于活性测定。

时间分辨荧光免疫分析法检测产志贺毒素大肠杆菌

目的基于时间分辨荧光免疫分析技术,建立高灵敏性、高特异性的产志贺毒素II(StxⅡ)大肠杆菌(STEC)全自动超微量检测方法。方法以StxⅡ单克隆抗体S1D8包被96孔板,采用双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合Eu3+标记StxⅡ单克隆抗体S2C4,以β-二酮体为主的增强液为发光增强系统。建立StxⅡ双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法,并其对特异性、检出限、健全性进行评估。结果建立以StxⅡ为靶标的时间分辨荧光免疫法检测STEC法,检出限为0.023μg/L,与产StxI的STEC无交叉反应;平均回收率为98.95%,批内、批间CV分别为3.5%和4.7%。该方法灵敏性和特异性分别为100.0%和97.4%,阳性预测值和阴性预测值各是92.6%和100.0%,误诊率和漏诊率则分别是2.6%和0,假阳性率和假阴性率分别是2.6%和0。TRFIA检测StxⅡ毒素的诊断符合率为98.1%;约登系数为0.974,Kappa检验u系数为0.95。结论 StxⅡ时间分辨荧光免疫分析法灵敏度高、稳定性好,具有很好的临床应用前景。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病二价细胞灭活疫苗体液免疫效果及免疫保护率评价研究

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(GCRV)引起的草鱼养殖业一种严重的病毒性出血病,给草鱼养殖产业造成重大损失。该病毒是一种双链分节段RNA病毒,根据GCRV多个病毒分离株基因序列分析及临床发病特点,共有三种基因型GCRV,其中基因Ⅰ型和Ⅱ型较为流行。通过细胞分离培养基因Ⅰ型(GCRV-ZV8909)和Ⅱ型(GCRV-HZ13)GCRV,研制出草鱼出血病二价细胞灭活疫苗,通过绝对定量的方法,测定基因Ⅰ型和Ⅱ型的病毒含量分别为2.0×109及1.5×106 copies/mL。用生理盐水将其分别进行50倍稀释和100倍稀释,包括原液及生理盐水对照共4组,分别腹腔注射免疫(20±5)g健康草鱼,剂量均为0.2 mL/尾,每组40尾,各组于免疫后3、5、7、14、21、28、42、56、70、84 d分别取3尾采集血液制备血清。分别利用经原核表达并纯化制备两种基因型GCRV的VP7蛋白以及实验室保存的草鱼IgM单抗,建立了三抗体夹心酶联免疫方法(TAS-ELISA)分析评价疫苗体液免疫效果。结果表明,草鱼经腹腔注射不同剂量的细胞灭活疫苗后,与对照组相比,各免疫组血清抗体均有不同程度的提高,且原液组与50倍稀释组基本持平,但都高于100倍稀释组,各免疫组在免疫后5 d即可检测到两种基因型GCRV抗体,且抗体水平持续到84 d,但两种基因型抗体水平达到高峰的时间不一致,抗基因Ⅰ型GCRV抗体达到高峰是在28 d,抗基因Ⅱ型GCRV抗体是在14 d达到高峰。两种基因型抗体水平达到高峰时的血清效价分别为1︰800、1︰600。免疫保护率实验结果表明,原液组保护率最高,为67%,50倍稀释组为60%,100倍稀释组只有33%。