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构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究 被引量:1
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作者 赵艳娜 邱荣 +1 位作者 沈南 唐元家 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期297-301,共5页
目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-... 目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。 展开更多
关键词 诱导型CRISPR/Cas9系统 Dox诱导型sgrna表达载体 造血干细胞 基因编辑 巨噬细胞
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