稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNAoligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNAoligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNAoligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1mRNA,采用Westernblotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均<0.05;N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均>0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。

天麻动力相关蛋白GeDRP1E基因的克隆及功能初探

基于天麻转录组数据,设计特异引物,克隆天麻DRP1E(dynamin-related protein 1E)基因,命名为GeDRP1E(GenBase登录号为C_AA018577.1),借助ExPASy、ClustalW、MEGA等软件对基因进行生物信息学分析利用拟南芥、马铃薯遗传转化体系获得转基因植株,并对转基因拟南芥株高、结实率,转基因马铃薯微型薯的块茎长、宽、重量和淀粉含量等农艺性状进行检测和分析,初步解析GeDRP1E基因的功能。结果显示,GeDRP1E基因ORF全长1899 bp、编码632个氨基酸残基,相对分子质量为69.90 kDa,分子式为C3079H4973N883O933S19;理论等电点为7.27,不稳定系数为43.34,亲水性平均指数为-0.259,预测属于不稳定亲水性蛋白。GeDRP1E不存在跨膜结构,无信号肽,定位于细胞质。系统进化树显示,GeDRP1E与其他种类植物DRP1E蛋白之间具有较高的同源性,其中与铁皮石斛DcDRP1E(XP_020689662.1)同源性最高,为90.05%。运用双酶切法构建植物表达载体pCambia1300-35Spro-GeDRP1E,并通过农杆菌介导转化法获得了GeDRP1E基因的拟南芥互补突变体、马铃薯过表达株系。与拟南芥AtDRP1E基因突变体相比,GeDRP1E基因互补突变体株高、结实率表型得以恢复。与野生型马铃薯相比GeDRP1E基因过表达株系微型薯体积、重量显著增大,淀粉含量显著增高。初步推测GeDRP1E很可能参与调节线粒体的形态,从而影响拟南芥植株、马铃薯微型薯的生长发育。上述研究结果为深入阐明天麻块茎生长发育的分子机制奠定了基础。

慢性氟中毒对大鼠神经细胞线粒体分裂蛋白Drp1表达的影响

目的研究慢性氟中毒大鼠大脑皮质神经细胞线粒体分裂基因动态相关蛋白1（Drp1）表达的改变。方法将120只sD大鼠（1月龄、体重100—120g）以单纯随机法分为3组（对照组、低氟组和高氟组），每组40只，各组染毒剂量以饮水中加入氟剂量计算：分别为0、10和50mS／L；染毒3个月和6个月时，每组分别处死20只。采用免疫组织化学方法和免疫蛋白印迹法（western—blotting）检测线粒体分裂蛋白Drp1表达。结果3个月时，Drpl的蛋白免疫组织化学强阳性表达神经细胞个数发生了改变，与对照组[（36．3±5．8）个]相比较，低氟组[（34．7±4．1）个]的改变无统计学意义（t=1．5，P〉0．05），而高氟组[（45．0±d．7）个]表达增加（t=8．8，P〈0．05）；western—blotting法蛋白印迹平均灰度值也具有相同的改变，与对照组（0．59-t-O．03）相比，低氟组（0．62±0．03）和高氟组（0．71±0．02）的水平升高（t值分别为0．02、0．11，P值均〈0．05）。6个月时，Drpl的蛋白免疫组织化学强阳性表达神经细胞个数发生了改变，与对照组[（33．2±4．4）个]相比较，低氟组[（36．6±3．8）个]和高氟组[（39．4±4．2）个]升高（t值分别为3．5，6．3，P值均〈0．05）；western—blotting法蛋白印迹平均值也有改变，与对照组（0．65-t-O．06）相比，低氟组（0．804-0．09）和高氟组（0．764-0．08）的水平升高（t值分别为0．1、0．1，P值均〈0．05）。结论高剂量染氟可造成分裂基因Drp1表达改变，慢性氟中毒神经细胞损伤可能与线粒体分裂亢进有关。