小鼠肝脏原位持续灌流方法的建立及其在肝脏非实质细胞分离中的应用

目的建立一种小鼠肝脏原位持续灌流的方法,并将该法应用于肝脏非实质细胞的分离。方法利用三通管和静脉留置针将门静脉、蠕动泵软管以及下腔静脉连接形成封闭回路,自门静脉端注入37℃的胶原酶消化液约60 ml,调节蠕动泵转速为20 ml.min-1行循环灌注约30 min,摘除肝脏剪切成小块组织,加入胶原酶孵育液消化30 min后碾碎制备成细胞悬液,离心后取沉淀先后以50%和35%的Per-coll密度离心即可获得小鼠肝非实质细胞。结果肝脏非实质细胞的得率为0.5×107～1×107个/鼠肝,流式检测CD45+细胞占(27.21±1.47)%。结论胶原酶肝脏原位持续灌流+体外孵育消化结合Percoll密度离心是分离小鼠肝脏非实质细胞的可靠方法。

UPLC-MS/MS法测定大鼠肝微粒体中26-OH-PD的含量

建立测定大鼠肝微粒体孵育液中26-OH-人参二醇(26-OH-PD)含量的方法。肝微粒体孵育液样品处理采用蛋白沉淀法,利用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法,样品以V(甲醇)∶V(水)(10mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸)=83∶17为流动相进行分离,以多反应离子监测方式进行定量分析,用于监测的离子为m/z 477.4→143.1(26-OH-PD),477.4→143.1(内标PDQ)。2.5min内完成26-OH-PD的检测,工作曲线线性范围为0.02μmol/L^4μmol/L,日内、日间精密度分别小于4.49%、7.00%,平均回收率为93.9%~96.8%,稳定性的RSD小于8.83%。本方法专属性强、灵敏度高且快速,可以用于肝微粒体孵育液样品中26-OH-PD的检测。

中药药理学体外实验方法研究进展

体外实验是中药药理学研究不可或缺的方法,但由于中药来源广泛、成分多样、理化性质不稳定等因素阻碍了其体外实验的开展。因此,寻找更为科学、合理的体外药理学研究方法已成为亟待解决的问题。目前中药药理学体外实验常用的方法有直接给药法和间接给药法,间接给药法又包括含药血清/浆法、含药肠吸收液法、含药肝孵育液法等。随着计算机技术和系统生物学的发展,将高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、组学、网络药理学、计算机/人工智能辅助药物设计等技术与中药体外实验方法相结合,不仅大大降低了科研实验成本,还明显提高了中药药理作用探索、有效成分筛选及药物研发的效率,已逐渐被认可并广泛应用。该文就目前常用的中药药理学体外实验方法及其进展做一梳理,以期为选择合理的研究方法提供帮助。

基于含药肝孵育液法的麻黄-杏仁药对舒张支气管平滑肌的β2受体机制与效应成分验证

目的:分析麻黄-杏仁药对含药肝孵育液的解痉效应成分与效应指标之间的关联性,与分子对接及文献结果对比,进一步探讨含药肝孵育液法用于中药体外组织器官水平药理学研究的可行性。方法:采用HPLC法测定麻黄-杏仁药对含药肝孵育液中麻黄碱(X1)、伪麻黄碱(X2)、甲基麻黄碱(X3)、苦杏仁苷(X4)的含量;于乙酰胆碱和磷酸组胺预收缩的离体气管环痉挛模型,采用生物信号采集系统检测气管环张力变化,ELISA检测气管组织环磷酸腺苷(cAMP)与环磷酸鸟苷(cGMP)及二者比值变化;采用多元线性回归分析效应成分与效应指标的相关性;采用分子对接技术分析验证上述实验结果。结果:麻黄-杏仁药对能上调气管环舒张率(Y1)和cAMP/cGMP比值(Y2);以效应成分含量为自变量,效应指标变化为因变量,得回归方程分别为Y1=0.238 X1-0.105 X2+0.675 X3-0.097 X4-82.161(R2=0.961)和Y2=0.093 X1-0.056 X2+0.108 X3+0.017 X4-16.197(R2=0.999),效应成分与效应指标之间相关性较强,其对效应指标影响程度为:甲基麻黄碱>麻黄碱>伪麻黄碱>苦杏仁苷;分子对接结果表明效应成分与肾上腺素β2受体的结合程度与上述结果一致。结论:麻黄-杏仁药对含药肝孵育液用于体外支气管环的药效结果与分子对接及文献调研结果基本一致,进一步表明该方法用于中药体外组织器官水平药效学研究具有一定的可行性。

中药复方体外药理研究方法思考

中药复方的体外药理机制研究是明确中药复方效应靶点和清晰阐释中医药内涵的关键,然而中药复方不同于单一成分或化学药物,其物质基础不明、效应成分不清和复杂的成分组成等特点使中药复方的体外药理研究方法争议颇多。就细胞实验而言,直接干预方法多采用水煎液或醇提物直接加入细胞培养体系,间接干预方法主要为制备含药血清、含药肠吸收液、含药肝孵育液或含药脑脊液等加入细胞培养体系,亦或是筛选有效活性成分直接进行药理机制研究。然而,每种方法均存在一定的缺点,不能完全清晰地实现中药复方的体外机制研究,因此,针对不同研究需求,选择合适的中药复方体外药理研究方法,通过研究设计规避其缺点,优化出具备较高科学性和可重复性的研究方案是中药复方体外药理研究亟待解决的关键技术问题。

麻杏石甘汤含药肝孵育液对大鼠气道上皮细胞损伤的保护作用研究

目的探讨麻杏石甘汤含药肝孵育液对大鼠气道上皮细胞损伤的保护作用。方法按照麻黄-甘草三个配比(1∶4、4∶1、1∶1)制备麻杏石甘汤药液,通过外翻肠囊法、肝细胞短暂孵育分别制备含药肝孵育液A、B和C;以磷酸组胺复制气道上皮细胞损伤模型;造模后细胞分为模型组(完全培养基)、阳性对照组(200μmol·L^(-1)地塞米松)和实验A、B和C组(含药肝孵育液A、B和C),另取正常大鼠气道上皮细胞作为空白对照组。用流式细胞术检测总凋亡率,用荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内活性氧(ROS)含量,用蛋白质印迹(Western blot)法检测上皮细胞表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)蛋白的表达水平。结果空白对照组、模型组、阳性对照组和实验A、B、C组的细胞凋亡率分别为(21.29±0.94)%、(30.59±1.55)%、(23.16±1.76)%、(18.87±5.94)%、(17.93±5.26)%和(16.75±2.06)%,细胞内活性氧(ROS)水平分别为1.00±0.06、1.84±0.26、0.97±0.13、0.86±0.23、0.92±0.05和1.07±0.14,EGFR蛋白相对表达水平分别为0.69±0.04、1.01±0.10、0.48±0.01、0.57±0.16、0.30±0.07和0.34±0.05,PI3K蛋白相对表达水平分别为0.38±0.01、0.59±0.01、0.40±0.01、0.35±0.15、0.14±0.01和0.20±0.04;实验A、B和C组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论麻杏石甘汤含药肝孵育液可能通过降低细胞活性氧水平,抑制细胞凋亡,调控EGFR/PI3K蛋白的表达,从而达到减轻气道上皮细胞损伤的作用。

基于差异性成分分析的麻杏石甘汤含药肝孵育液体外药效学初步研究

目的:以含药血清为对照,通过检测分析麻杏石甘汤(Maxing Shigan Decoction, MSD)含药肝孵育液的显著性差异成分及其含量、变异系数,为含药肝孵育液的质量控制提供参考,初步探讨其用于MSD体外药效学研究的可行性。方法:应用三重四级杆液-质联用(TSQ-Quantis)技术,采集13组MSD水煎液数据,采用正交偏最小二乘判别分析法分析得到水煎液的差异性成分;采集不同批次MSD含药肝孵育液和含药血清数据,找到二者的差异性成分,计算各成分的含量并分析其RSD。体外药效学实验分为正常组、模型组、含药肝孵育液(2.5%,5%,10%)和含药血清(2.5%,5%,10%)组,用磷酸组胺处理复制支气管上皮细胞损伤模型,分别给予相应药物孵育36 h后,Western blot检测各组磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)蛋白的相对表达量,并计算RSD。结果:与水煎液的8个差异性成分相比,含药肝孵育液和含药血清的差异性成分均有7个;含药肝孵育液中差异性成分的含量高,且不同批次间各成分的RSD均小于10%。含药肝孵育液组和含药血清组(2.5%)PI3K蛋白表达降低(P<0.05),含药肝孵育液和含药血清组Akt蛋白的表达均显著降低(P<0.05),且各含药肝孵育液组PI3K和Akt相对表达量的RSD均小于10%。结论:MSD含药肝孵育液中的差异性成分近似于含药血清,该体系成分含量高、稳定性好;对上皮细胞损伤模型PI3K和Akt蛋白表达的作用趋势与含药血清一致,且结果重现性好;结合其模拟口服中药肠吸收后经肝入血的全过程等优点,初步表明含药肝孵育液用于MSD体外药效学研究有一定的可行性。

基于含药肝孵育液法的麻杏石甘汤抗气道上皮损伤的作用机制研究

目的结合体内外实验探讨含药肝孵育液法用于中药体外药理学研究的可行性及麻杏石甘汤抗气道上皮损伤的作用机制。方法SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(dexamethasone,Dex)及麻杏石甘汤组(中药配比方A、B、C、D),麻杏石甘汤干预大鼠哮喘模型,记录引喘潜伏期,病理切片观察气管组织病理形态和气道上皮细胞超微结构变化,原位杂交和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测表皮生长因子受体(EGFR)mRNA和蛋白表达;SD雄性大鼠离体气管随机分为正常组、模型组、布地奈德福莫特罗组(budesonide and formoterol fumarate powder for inhalation,BF)及麻杏石甘汤含药肝孵育液组(中药配比方A、B、C、D),麻杏石甘汤含药肝孵育液干预大鼠离体气管损伤模型,记录气管张力变化,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测气管EGFR、血管内皮生长因子(VEGF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量水平,原位杂交和免疫组化分别检测磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)mRNA和蛋白表达;大鼠气道上皮细胞(RTE)随机分为正常组、模型组、地塞米松组及麻杏石甘汤含药肝孵育液组(中药配比方A、B、C、D),麻杏石甘汤含药肝孵育液干预RTE细胞损伤模型,流式细胞术检测RTE细胞损伤率,Western blot检测RTE细胞EGFR、PI3K蛋白表达。结果整体研究表明,与正常组比较,模型组气管组织EGFR mRNA和蛋白表达显著升高,气管组织结构形态和上皮细胞超微结构受损;与模型组比较,给药组均可延长大鼠引喘潜伏期,修复气管组织结构形态和上皮细胞超微结构损伤,并下调EGFR mRNA和蛋白表达,以A组药效最为显著。离体组织研究表明,与正常组比较,模型组气管EGFR、VEGF、GM-CSF含量水平显著升高,PI3KmRNA和蛋白表达显著升高;与模型组比较,给药组均可舒张气管环张力,降低EGFR、VEGF、GM-CSF含量水平,并下调PI3K mRNA和蛋白的表达,以A组药效最为显著。离体细胞研究表明,与正常组比较,模型组RTE细胞损伤率显著增加,EGFR、PI3K蛋白表达显著升高;与模型组比较,给药组均可降低RTE细胞损伤,下调EGFR、PI3K蛋白表达,以A组药效最为显著。结论含药肝孵育液法用于体外药理学研究对各药效指标影响的作用趋势与体内药理作用相一致,具备较好的可行性;麻杏石甘汤减轻气道上皮损伤可能是通过调节EGFR/PI3K信号通路和抑制气道重塑发挥作用。

UPLC-MS/MS法测定大鼠肝微粒体中26-OH-PD的含量

建立测定大鼠肝微粒体孵育液中26-OH-人参二醇(26-OH-PD)含量的方法。肝微粒体孵育液样品处理采用蛋白沉淀法,利用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱,样品以甲醇∶水(10mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸)=83∶17为流动相进行分离,以多反应离子监测方式进行定量分析,用于监测的离子为m/z 477.4→143.1(26-OH-PD),477.4→143.1(内标PDQ)。2.5min内完成26-OH-PD的检测,工作曲线线性范围为0.02μmol/L^4μmol/L,日内、日间精密度分别小于4.49%、7.00%,平均回收率为93.9%~96.8%,稳定性的RSD小于8.83%。本方法专属性强、灵敏度高且快速,可以用于肝微粒体孵育液样品中26-OH-PD的检测。

中药体外药理学研究方法与改进

通过总结现有中药体外药理学研究方法:含药血清法、含药脑脊液法和含药肠吸收液法的研究进展,比较各自优缺点,为更可靠的中药体外药理学研究新方法的探讨提供参考。针对含药肠吸收液法提出了改进思路与方法——含药肝孵育液法,并分析了其优缺点,为中药体外药理学实验方法的探索提供借鉴,促进中药药效物质和作用机制研究多模式发展。