根癌农杆菌介导Ds转座因子的水稻遗传转化

以水稻品种中花11的幼胚、成熟胚和幼穗的愈伤组织为材料，经携带Ti质粒pDs－Bar1300的根癌农杆菌EHA105感染和共培养后，通过50mg／L和25mg／L潮霉素的二次筛选，结果表明34％幼胚愈伤组织、17％成熟胚愈伤组织和16．5％幼穗愈伤组织表现潮霉素抗性。这些抗性愈伤组织转入分化和再生培养基培养，获得了14棵转基因植株。经Southern杂交分析，证明Ds和Bar基因都已整合进转基因植株的染色体组。对T1代植株的PPT抗性测定表明，外源Bar基因的分离符合孟德尔法则。

含Ds转座因子的T-DNA在水稻染色体上的分布研究

应用农杆菌介导的方法获得了有Ds因子插入的3000多株水稻转化群体,用Inverse PCR方法,从部分独立转化植株中分离了590条含Ds因子的T-DNA插入位点处的右侧旁邻水稻染色体序列.根据旁邻序列中T-DNA右边界与侧翼水稻序列之间的插入序列的特征可分成6个主要类别,其中类型Ⅰ是主要类型,为通常的T-DNA整合,即T-DNA右边界序列与水稻染色体序列相连,或者其间插入小于50 bp的序列片段;类型Ⅱ为T-DNA右边界旁先接T-DNA载体序列,再与水稻序列相接的重组类型.340个类型Ⅰ和Ⅱ的旁邻序列通过与已知的水稻染色体序列数据库一致性比较分析,确定了它们在水稻染色体上的分布位置,构建了一个Ds因子在水稻12条染色体插入的框架结构.这340个有Ds因子插入的位点在整个染色体上平均相距0.8 Mb.分析在第1条染色体上T-DNA(Ds)插入情况显示有21％的频率插入到预测基因的外显子中.T-DNA(Ds)在染色体上分布位置的确定,使我们可以选择合适的Ds因子插入株作为起始株系,导入Ac转座酶基因后,使Ds发生转座,从而获得新的Ds插入突变株,为进一步利用Ds转座标签法分离水稻基因创造了条件.