表达外源DsCOR转基因拟南芥的筛选及其抗寒性

为验证播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能,在实验室前期DsCOR基因大量研究的基础上,本研究通过农杆菌介导花序浸染法把诱导型表达载体PBI121-DsCORpro681-DsCOR转入COR15a缺陷型拟南芥中(A-S),筛选获得转DsCOR基因阳性苗(A-I),并测定了A-I、A-S和野生型(A-W)拟南芥在4℃低温胁迫下的叶片脯氨酸含量、电解质渗透率和幼苗在-4℃下存活率等抗寒生理指标;使用Real-time quantitative RT-PCR检测A-I在低温胁迫下DsCOR基因的表达规律.结果显示,A-W和A-I两种植株叶片脯氨酸含量在低温处理过程中显著增加,从处理前70μg g^(-1)到处理后12h分别升至453μg g^(-1)和406μg g^(-1)并趋于稳定,A-S叶片脯氨酸含量变化不大(30^(-1)05μg g^(-1)).随着处理时间增加,A-S叶片电解质渗透率升高较明显,36 h后达到45.2%;而A-W和A-I两种植株叶片电解质渗透率最高分别达到14.3%和16.3%.幼苗存活率统计结果显示,A-S缺失COR15a后,在-4℃处理后该株系幼苗全部死亡,而A-W和A-I两个株系都有较高的存活率,分别达到53%和83%.抗寒生理指标结果表明转DsCOR基因拟南芥的抗寒能力已得到显著提高,达到野生型拟南芥水平.Real-time quantitative RT-PCR检测显示DsCOR基因在A-I中表达明显受到低温胁迫诱导.综上,DsCOR基因在COR15a缺陷型拟南芥中实现了成功表达,并显著提高了其抗寒性,最终验证了播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能.

播娘蒿DsCOR蛋白纯化、抗体制备及对冷诱导的响应

为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)极强的抗寒特性,在大肠杆菌中重组表达已克隆的播娘蒿抗寒基因DsCOR,比较Ni亲合层析和煮沸-透析袋电洗脱蛋白纯化方法,制备纯化的DsCOR重组蛋白多克隆抗体,Western Blotting检测播娘蒿在寒冷胁迫下DsCOR的表达特性.结果表明,两种纯化技术均能纯化DsCOR蛋白,透析袋电洗脱法纯化蛋白浓度为1.21mg/mL,是Ni亲和层析法纯化蛋白浓度的2倍,且经PEG8000浓缩后的蛋白总量分别为9.075mg和4.256mg;制备的DsCOR抗体效价达1:12800,Western Blotting检测显示只有经过低温冷诱导的播娘蒿DsCOR蛋白才表达,证明了DsCOR基因受低温诱导的规律.