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LOXP-DsRed-LOXP系统的构建及其应用
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作者 宋丹 郑勇斌 +4 位作者 童仕伦 肖旷 杨超 孙伟 秦凯迪 《中国医药导报》 CAS 2017年第33期4-8,F0004,共6页
目的构建荷载LOXP-Ds Red-LOXP系统的细胞,并探索该系统在体内外检测Cre酶活性中的应用。方法构建稳转株MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP)并体外验证检测Cre酶效能。将Balb/c裸鼠随机分为两组(n=10),分别在结直肠黏膜下移植MCA38^(Cre-Lucifera... 目的构建荷载LOXP-Ds Red-LOXP系统的细胞,并探索该系统在体内外检测Cre酶活性中的应用。方法构建稳转株MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP)并体外验证检测Cre酶效能。将Balb/c裸鼠随机分为两组(n=10),分别在结直肠黏膜下移植MCA38^(Cre-Luciferase)与MCA38^(Luciferase)细胞株,两周后取灌肠液作用于MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP),验证该系统体内检测Cre酶效能。APC^(LOXP/LOXP)小鼠随机分为两组(n=20),分别使用可表达Cre酶及荧光素酶(Luciferase)的慢病毒颗粒(CL组)与仅表达Luciferase的慢病毒颗粒(L组)行小鼠结直肠黏膜下注射,感染后第3天及第3周末取灌肠液检测Cre酶活性及表达情况,同时行小鼠活体成像检测Luciferase表达情况,验证该系统在判断Cre酶活性与预测基因修饰成功率中的应用。结果 Cre重组酶作用于MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP48) h后,红色荧光明显减弱。裸鼠灌肠液作用于MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP)细胞株48 h后,MCA38^(Cre-Luciferase)组红色荧光明显减弱。CL组模型鼠病毒注射后第3天检出16只小鼠荧光素酶及灌肠液Cre酶阳性,第3周末8只小鼠荧光素酶及灌肠液Cre酶阳性。L组模型鼠病毒注射后第3天检出17只小鼠荧光素酶阳性而灌肠液Cre酶均阴性,第3周末检出8只小鼠荧光素酶阳性,灌肠液Cre酶均阴性。结论成功构建Cre酶检出系统MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP),实现了体内、外无创性检测Cre酶活性及表达情况,并以此评价APC^(LOXP/LOXP)小鼠结直肠黏膜基底干细胞病毒感染效率及基因修饰情况。 展开更多
关键词 Cre酶 dsred荧光蛋白 LOXP-dsred-LOXP系统 结直肠癌
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红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的表达和观察及其在本科实验教学中的应用 被引量:10
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作者 邢万金 赵宇航 +1 位作者 任仕超 包晓红 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期548-551,601,共5页
用PCR方法从质粒pDsRed2-1中扩增获得DsRed2,亚克隆到pMD19-T载体上,然后酶切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET-Trx和pGEX-4T1上,转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.在LB平板培养基上或液体培养基中直接观察菌体颜色,最后用SDS-P... 用PCR方法从质粒pDsRed2-1中扩增获得DsRed2,亚克隆到pMD19-T载体上,然后酶切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET-Trx和pGEX-4T1上,转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.在LB平板培养基上或液体培养基中直接观察菌体颜色,最后用SDS-PAGE检测DsRed2蛋白的表达.结果显示构建的重组载体pET-Trx-DsRed2和pGEX-GST-DsRed2在E.coli中成功表达,且不形成多聚体.LB平板培养基上和IPTG诱导24h后的液体培养基中都能直接观察到红色荧光,说明DsRed2可以作为原核表达系统的报告基因. 展开更多
关键词 原核表达 红色荧光蛋白 dsred2 实验教学
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DsRED红色荧光蛋白植物表达载体的构建和表达 被引量:5
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作者 董伟欣 张月辰 张迎迎 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期13-16,共4页
为获得红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)真核表达载体35S-pC1301-DsRED,利用PCR将瞬时表达载体PGDR上的全长DsRED扩增下来并用XbaⅠ和BamHⅠ酶切该片段,同时用相同的内切酶消化中间载体pBluescript SK(+),连接两片段并测序,... 为获得红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)真核表达载体35S-pC1301-DsRED,利用PCR将瞬时表达载体PGDR上的全长DsRED扩增下来并用XbaⅠ和BamHⅠ酶切该片段,同时用相同的内切酶消化中间载体pBluescript SK(+),连接两片段并测序,将鉴定正确的DsRED用相同的内切酶切下并导入双元载体35S-pC1301,利用基因枪将正确质粒转染洋葱内表皮细胞瞬时表达DsRED。结果表明:35S-pC1301-DsRED真核表达载体已成功构建并在荧光共聚焦显微镜下呈现红光,即获得了可产生红色荧光的35S-pC1301-DsRED载体,为今后植物目的基因定位提供了阳性对照,同时中间载体pBluescript SK(+)-DsRED的构建为今后植物目的基因定位提供了实验工具。 展开更多
关键词 35S-pC1301-dsred 表达载体 真核 构建 红色荧光蛋白
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利用荧光探针DsRed-Mit的细胞凋亡形态学研究 被引量:4
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作者 刘镭 邢达 +1 位作者 陈同生 裴沂辉 《激光生物学报》 CAS CSCD 2006年第3期267-270,共4页
D sR ed-M it是一种特异性定位于线粒体的荧光分子探针。本文重点探讨了D sR ed-M it探针在观察细胞凋亡形态学、以及凋亡过程中动态分子调控过程研究中的应用。实验结果表明,在细胞凋亡过程中应用该探针标记线粒体,能够直观地监测线粒... D sR ed-M it是一种特异性定位于线粒体的荧光分子探针。本文重点探讨了D sR ed-M it探针在观察细胞凋亡形态学、以及凋亡过程中动态分子调控过程研究中的应用。实验结果表明,在细胞凋亡过程中应用该探针标记线粒体,能够直观地监测线粒体肿胀的形态变化,以及细胞凋亡的重要蛋白--Bax蛋白转位线粒体和细胞色素C释放的动态过程。 展开更多
关键词 dsred-Mit 细胞凋亡 形态学研究
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以DsRed2基因为可视标记的双T-DNA共转化载体的构建 被引量:1
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作者 许明 黄志伟 +3 位作者 程祖锌 刘峰 卓学铭 郑金贵 《福建农林大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2010年第3期263-268,共6页
本研究构建了以红色荧光蛋白基因DsRed2作为可视标记的双T-DNA共转化载体PCDMAR-DsRed2-hpt.该载体含有2个独立的T-DNA结构区,其中一个T-DNA区同时含有选择标记基因hpt和红色荧光蛋白基因DsRed2;另一个T-DNA区含有一个通用的多克隆位点... 本研究构建了以红色荧光蛋白基因DsRed2作为可视标记的双T-DNA共转化载体PCDMAR-DsRed2-hpt.该载体含有2个独立的T-DNA结构区,其中一个T-DNA区同时含有选择标记基因hpt和红色荧光蛋白基因DsRed2;另一个T-DNA区含有一个通用的多克隆位点,可任意插入目的基因,在多克隆位点两端含有两段顺式重复的烟草Rb7MARs,用来增强目的基因的稳定表达.此载体可用于高效培育无选择标记的转基因植物. 展开更多
关键词 双T-DNA 共转化 MAR序列 dsred2 无选择标记
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含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6构建 被引量:2
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作者 郭超 Alexander Endler +2 位作者 张敬 石红军 张军 《同济大学学报(医学版)》 CAS 2008年第1期17-20,共4页
目的构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6,便于利用荧光显微镜、FACS等实验技术开展RNA干扰研究。方法质粒pDsRed2-N1中DsRed2蛋白的编码基因BbsⅠ酶切位点无意突变后,破坏pDsRed2-N1多克隆位点,PCR扩增CMV启... 目的构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6,便于利用荧光显微镜、FACS等实验技术开展RNA干扰研究。方法质粒pDsRed2-N1中DsRed2蛋白的编码基因BbsⅠ酶切位点无意突变后,破坏pDsRed2-N1多克隆位点,PCR扩增CMV启动子、DsRed2蛋白基因片段并将其克隆至RNA干扰载体pSilencerU6,得到pDsRed2-SilencerU6质粒,利用脂质体转染技术将其转染HEK293T细胞,荧光显微镜、FACS检测转染效率。结果DsRed2蛋白编码基因序列BbsⅠ点突变正确,成功构建pDsRed2-SilencerU6载体,其在HEK293T细胞中可显著表达红色荧光蛋白,利用脂质体转染技术,转染效率达70.61%。结论成功构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6并在哺乳动物细胞中表达,为今后开展RNA干扰研究提供了基础。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 dsred2 RNA干扰 U6启动子
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带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达 被引量:2
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作者 彭云 潘远旺 +5 位作者 钱琰琰 郑清银 姜岚 曹广力 薛仁宇 贡成良 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1177-1182,共6页
为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动Ds... 为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。 展开更多
关键词 家蚕 丝胶启动子 丝素重链基因 信号肽 dsred BmN细胞 丝腺
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含DsRed类似生色团的红色荧光蛋白的发展及应用 被引量:4
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作者 王志芳 安建梅 孔建强 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期197-206,共10页
自从绿色荧光蛋白(GFP)被发现以来,荧光蛋白在生物医学领域已经成为一种重要的荧光成像工具.随着红色荧光蛋白DsRed的出现,各种优化的DsRed突变体和远红荧光蛋白也不断涌现.其中荧光蛋白生色团的形成机制对改建更优的荧光蛋白变种影响很... 自从绿色荧光蛋白(GFP)被发现以来,荧光蛋白在生物医学领域已经成为一种重要的荧光成像工具.随着红色荧光蛋白DsRed的出现,各种优化的DsRed突变体和远红荧光蛋白也不断涌现.其中荧光蛋白生色团的形成机制对改建更优的荧光蛋白变种影响很大,对于红色荧光蛋白而言,大多数的红色荧光蛋白的生色团类型为DsRed类似生色团,在此基础上又出现了Far-redDsRed类似生色团.目前,含DsRed类似生色团的荧光蛋白主要有单体红色荧光蛋白、光转换荧光蛋白、斯托克斯红移蛋白、荧光计时器等.这些优化的荧光蛋白作为分子探针可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪,已经在生物工程学、细胞生物学、基础医学领域得到广泛应用.本文综述了含DsRed类似生色团的荧光蛋白的研究进展及其应用,以及由此发展起来的远红荧光蛋白在活体显微成像技术中的应用,并展望了荧光探针技术研究的新方向. 展开更多
关键词 dsred类似生色团 远红荧光蛋白 荧光显微成像
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耐热木聚糖酶xynB_(64)和红色荧光蛋白Dsred2的融合表达及其应用 被引量:1
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作者 白羽 申宁 《安徽农业科学》 CAS 2012年第7期3891-3893,共3页
[目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿... [目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿素复性的包涵体。[结果]红色荧光蛋白Dsred2促进了目的蛋白可溶性表达,重溶包涵体经激发后发射光波长在583 nm,光强度与可溶性大致成正比。[结论]研究表明红色荧光蛋白Dsred2在包涵体复性中可作为报告蛋白,该结果为工业化复性包涵体提供了检测依据。 展开更多
关键词 耐热木聚糖酶xynB64 红色荧光蛋白dsred2 原核表达 包涵体
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转DsRed荧光蛋白的新月弯孢Curvularia lunata菌株构建 被引量:4
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作者 陈茂功 韩志群 +3 位作者 林小虎 王晓鸣 周印富 李洪杰 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期16-21,共6页
本研究通过农杆菌介导转化方法(ATMT),利用DsRed荧光蛋白基因对玉米弯孢叶斑病致病菌新月弯孢进行遗传转化。通过转化子的荧光蛋白基因和潮霉素B抗性基因的PCR检测,菌丝体和分生孢子的荧光观察,hyg基因的Southern杂交验证,以及荧光蛋白... 本研究通过农杆菌介导转化方法(ATMT),利用DsRed荧光蛋白基因对玉米弯孢叶斑病致病菌新月弯孢进行遗传转化。通过转化子的荧光蛋白基因和潮霉素B抗性基因的PCR检测,菌丝体和分生孢子的荧光观察,hyg基因的Southern杂交验证,以及荧光蛋白基因插入位点的TAIL-PCR分析,确定了DsRed荧光蛋白基因插入与表达对新月弯孢转化子的影响。结果表明:测定的4株转化子基因组中均成功整合了DsRed荧光蛋白目的基因片段;转化子在生长发育和致病性方面与野生型菌株存在一定差异,分别有2株在产孢量方面略高于野生型菌株,4株转化子在纤维素酶活性和粗毒素致病力方面均低于野生型菌株,有3株转化子在果胶酶活性上较野生型菌株有提高,1株转化子的致病力显著低于野生型菌株;获得其中3个转化子插入位点的侧翼序列。 展开更多
关键词 玉米 新月弯孢 农杆菌介导转化 红色荧光蛋白
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pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体的构建及vigilin重组慢病毒包装
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作者 沈文燕 李冉 +4 位作者 覃扬 杨文理 刘秋英 魏玲 俞小琴 《西部医学》 2014年第2期142-145,共4页
目的构建pCS-CG-DsRed2-vigilin慢病毒重组载体,以及包装pCS-CG-DsRed2-vigilin重组慢病毒。方法用NheⅠ、NotⅠ将目的片段红色荧光蛋白基因DsRed2从pDsRed2-N1中切下,连入pcDNA3.1(-)上,再用Kpn1从pcDNA3.1(-)-DsRed2中切下DsRed2片段... 目的构建pCS-CG-DsRed2-vigilin慢病毒重组载体,以及包装pCS-CG-DsRed2-vigilin重组慢病毒。方法用NheⅠ、NotⅠ将目的片段红色荧光蛋白基因DsRed2从pDsRed2-N1中切下,连入pcDNA3.1(-)上,再用Kpn1从pcDNA3.1(-)-DsRed2中切下DsRed2片段插入pCS-CG-vigilin中。用相应的内切酶鉴定,阳性克隆送测序鉴定。采用三质粒系统包装慢病毒并分别感染HEK293T和HepG2细胞。结果电泳显示,构建的pCS-CG-DsRed2-vigilin用KpnⅠ和SacⅡ分别单酶切切下800bp和600bp的插入片段,阳性克隆质粒测序结果与pDsRed2-N1中DsRed2序列一致;HEK293T和HepG2细胞感染后均能观察到较强的红色荧光。结论带有红色荧光基因的pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体构建成功;成功包装出带红色荧光标签的vigilin重组慢病毒,且该病毒具有较高的感染效率。 展开更多
关键词 vigilin dsred2荧光蛋白 重组载体 重组慢病毒
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红色荧光蛋白基因DsRED在核桃植株再生过程中的表达稳定性 被引量:2
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作者 任飞 张佳琦 +4 位作者 胡恒康 梁璧 黄有军 娄和强 张启香 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第12期166-176,共11页
【目的】报告基因是编码易被检测的蛋白质或酶的基因。红色荧光蛋白基因DsRED因其优异的适用特性已作为报告基因广泛应用于动植物以及酵母等真核细胞内基因表达的研究。课题组前期已将DsRED成功转入核桃体细胞胚,阳性体胚生长及增殖正... 【目的】报告基因是编码易被检测的蛋白质或酶的基因。红色荧光蛋白基因DsRED因其优异的适用特性已作为报告基因广泛应用于动植物以及酵母等真核细胞内基因表达的研究。课题组前期已将DsRED成功转入核桃体细胞胚,阳性体胚生长及增殖正常、阳性再生植株长势良好。本研究通过对核桃体细胞胚和再生植株中DsRED基因的跟踪研究,探讨DsRED作为报告基因在核桃再生植株中的表达是否稳定以及对再生植株的后续生长和发育是否具有影响,同时为进一步拓宽DsRED作为报告基因的应用范围提供参考。【方法】通过荧光显微镜检测核桃体细胞胚、继代培养3年的组培苗以及3年生温室苗的DsRED荧光表达的稳定性,并通过PCR、qRT-PCR以及Western Blot技术检测DsRED基因及其编码蛋白在核桃体细胞胚和组培苗中表达的稳定性。同时,通过对DsRED组培苗及3年生苗的形态指标进行测定,从而明确DsRED作为外源报告基因的可靠性。【结果】核桃DsRED体细胞胚在白光下呈粉红至红色,荧光下呈明亮的红色;与对照相似,DsRED体细胞胚发育也经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚阶段,且形态正常。DsRED组培苗和3年生苗在荧光下植株表面呈现明亮的红色,而对照无激发,视野中呈现黑色,且白光下二者表型一致。DsRED组培苗和3年生苗的茎、叶生长参数与对照相比无显著差异。显微结构荧光检测发现,DsRED在组培苗和3年生苗营养器官的维管束部位表达量较高。对核桃DsRED体胚和组培苗进行PCR检测发现DsRED体胚和组培苗均可扩增获得目的条带,与预期条带大小一致(681 bp);qRT-PCR检测结果显示,DsRED组培苗各组织及DsRED体胚的DsRED mRNA表达量无显著性差异,而对照体胚和组培苗中表达量为0。Western Blot检测结果表明,DsRED组培苗和体胚有26 kDa强阳性条带,对照植株中无特异性条带,进一步分析条带灰度,结果表明DsRED组培苗各组织间及DsRED体胚的DsRED表达量无显著性差异,而对照相应结构中表达量均为0。【结论】DsRED基因转入核桃体胚后,可在体胚和继代培养3年的组培苗中正常翻译和稳定表达,3年生温室苗DsRED表达稳定且植株表型正常,表明DsRED是核桃理想的遗传转化报告基因。研究结果可为DsRED作为报告基因在果树中的应用提供参考。 展开更多
关键词 核桃 报告基因 红色荧光蛋白 dsred 体细胞胚 再生植株
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Difference between resistant and susceptible maize to systematic colonization as revealed by DsRed-labeled Fusarium verticillioides
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作者 Lei Wu Xiaoming Wang +1 位作者 Rongqi Xu Hongjie Li 《The Crop Journal》 SCIE CAS 2013年第1期61-69,共9页
Fusarium verticillioides was labeled with DsRed via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation to examine differences in colonization and reactions of resistant and susceptible inbred lines of maize(Zea mays L.... Fusarium verticillioides was labeled with DsRed via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation to examine differences in colonization and reactions of resistant and susceptible inbred lines of maize(Zea mays L.). The extent of systemic colonization of F. verticillioides in roots from maize lines either resistant or susceptible to the fungus was studied by visualizing the red fluorescence produced by the fungus expressing DsRed. The difference in quantities of colony forming units(CFU) in roots and basal stems, production of fumonisin B1, and pH of root were determined. Although F. verticillioides colonized both resistant and susceptible lines, differences were observed in the pattern and extent of fungal colonization in the two types of maize lines. The fungus colonized the susceptible lines producing mosaic patterns by filling the individual root cells with hyphae. Such a pattern of colonization was rarely observed in resistant lines, which were less colonized by the fungus than the susceptible lines in terms of CFUs. The production of mycotoxin fumonisin B1 in roots from different lines was closely correlated with the amount of F. verticillioides colonization, rather than the pH or amylopectin concentrations in the root. The findings from this study contribute to a better understanding of the defense mechanism in resistant maize lines to F. verticillioides. 展开更多
关键词 dsred ZEA mays Infection FUMONISIN Colony forming unit CFU
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编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因的串联DsRed荧光表达盒的CRISPR/Cas9系统的构建及验证
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作者 曹晓晴 祁显涛 +1 位作者 刘昌林 谢传晓 《作物学报》 CAS 2024年第8期1961-1970,共10页
CCT家族基因影响植物开花,在玉米中,ZmCCT10、ZmCCT9基因是光周期敏感基因,ZmGhd7基因是与开花期相关的基因。利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为研究基因的功能和快速改良玉米的开花期提供了可能。本研究以玉米... CCT家族基因影响植物开花,在玉米中,ZmCCT10、ZmCCT9基因是光周期敏感基因,ZmGhd7基因是与开花期相关的基因。利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为研究基因的功能和快速改良玉米的开花期提供了可能。本研究以玉米ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为编辑对象,以KN5585为稳定转化受体、以CML312SR、LCL-1、LCL-2为预改良的晚熟材料受体,首先通过Sanger测序验证了3个基因靶标区域在4份玉米材料中的保守性,其次根据sgRNA设计原则选择了1个sgRNA复合编辑3个基因,并利用同源重组方法构建了将由胚特异性启动子Zm3896驱动的DsRed表达盒和由ZmU6-2启动子驱动的sgRNA表达盒串联的CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体CCT-CPD,然后采用酶切法和Sanger测序法分析T0代KN5585中3个基因的突变率和突变类型,验证了该系统的基因编辑效果,最后通过对稳定遗传转化植株所结籽粒在籽粒水平、组织水平进行DsRed荧光标记表型鉴定,验证了该系统中DsRed荧光筛选标记的有效性。在此基础上,通过杂交育种法以晚熟材料为母本、以T1代KN5585阳性株为父本获得F1并经过DsRed荧光筛选获得含有有效编辑转基因元件的晚熟材料。本研究构建的编辑ZmCCT10/ZmCCT9/ZmGhd7基因的串联DsRed荧光表达盒的CRISPR/Cas9系统为创制单基因突变体,双基因突变体,三基因突变体奠定了基础,该系统中DsRed荧光筛选标记的应用可以快速筛选区分有无转基因成分的玉米籽粒,成本低,鉴定效率高,具有大规模籽粒筛选的潜力,本研究为鉴定ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7三个基因的功能和创制玉米光周期钝感材料奠定了材料基础和高效的技术基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 dsred荧光 ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因 玉米
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红色荧光蛋白基因DsRed2植物表达载体的构建及遗传转化 被引量:2
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作者 高嵩 何欢 +6 位作者 吕庆雪 孙蕾 李毅丹 宋广树 张志军 王敏 刘文国 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期1718-1723,共6页
本研究通过简单检测DsRed2基因的表型就能快速筛出含有目的基因的成熟籽粒。DsRed2是一种在激发光下呈红色的荧光蛋白,根据在GenBank中获得的DsRed2及其特异性启动子Ltp2的基因序列,设计特异性引物,并构建筛选标记为Bar基因的植物表达载... 本研究通过简单检测DsRed2基因的表型就能快速筛出含有目的基因的成熟籽粒。DsRed2是一种在激发光下呈红色的荧光蛋白,根据在GenBank中获得的DsRed2及其特异性启动子Ltp2的基因序列,设计特异性引物,并构建筛选标记为Bar基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2,通过农杆菌介导法转入玉米品种郑单958中。经除草剂筛选获得210株抗性植株,PCR检测得到阳性植株80株,对PCR检测呈阳性的植株进行试纸条检测,结果表明红色荧光蛋白基因DsRed2已成功整合到玉米基因组中。通过标记基因的快速检测,从而减少后代筛选的工作量和降低制种成本,为转基因玉米新品种的筛选提供直观有效的筛选标记。 展开更多
关键词 玉米 dsred2基因 植物表达载体 遗传转化
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尾巨桉DH32-28组培再生过程中激素浓度筛选与转基因愈伤组织获得
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作者 张吴滔 白卫国 +7 位作者 苏国芬 费晓云 胡浩 付朝阳 韦利达 李蔷薇 李魁鹏 徐增富 《桉树科技》 2024年第2期1-10,共10页
探索尾巨桉良种无性系DH32-28的组培再生体系,进而建立稳定的遗传转化系统,以期为进一步获得转基因桉树再生植株,以及开展桉树基因功能及分子育种研究提供参考。以DH32-28组培苗叶片和茎段为外植体,通过筛选植物生长调节剂噻苯隆(TDZ)... 探索尾巨桉良种无性系DH32-28的组培再生体系,进而建立稳定的遗传转化系统,以期为进一步获得转基因桉树再生植株,以及开展桉树基因功能及分子育种研究提供参考。以DH32-28组培苗叶片和茎段为外植体,通过筛选植物生长调节剂噻苯隆(TDZ)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、1-萘乙酸(NAA)以及吲哚丁酸(IBA)的合适浓度,进行外植体愈伤组织诱导、不定芽分化和生根诱导;通过测定愈伤组织诱导阶段以及生根诱导阶段组培材料对卡那霉素的耐受力,确定卡那霉素的临界筛选浓度,用于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化实验。结果表明:以MS为基本培养基,0.025 mg·L^(-1) TDZ+0.15 mg·L^(-1) NAA、0.05 mg·L^(-1) TDZ+0.15 mg·L^(-1) NAA的激素配比分别最适于DH32-28叶片和茎段的愈伤诱导,愈伤诱导率均为98.3%。将诱导出的叶片和茎段愈伤组织转移到含有0.5 mg·L^(-1) 6-BA+0.1 mg·L^(-1) NAA的不定芽分化培养基中,不定芽分化率分别为44.4%和96.7%。以1/2MS为基本培养基,添加0.5 mg·L^(-1)IBA对DH32-28再生芽的不定根诱导率最高,不定根诱导率为72.8%。愈伤组织和不定芽诱导阶段的卡那霉素最适筛选浓度为5 mg·L^(-1),生根阶段最适浓度为20 mg·L^(-1)。本研究成功建立了尾巨桉无性系DH32-28高效的再生体系,并采用农杆菌介导的遗传转化方法将红色荧光蛋白报告基因DsRed2导入到DH32-28茎段受体材料,获得了表达DsRed2的转基因愈伤组织。 展开更多
关键词 尾巨桉DH32-28 再生 遗传转化 dsred2
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家蚕丝素重链启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达 被引量:5
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作者 潘兴亮 曹广力 +1 位作者 薛仁宇 贡成良 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期761-766,共6页
根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,克隆了家蚕丝素重链基因(Fib-H)启动子及其下游的信号肽序列(FibHS),将DsRed基因与信号肽序列融合构建了分泌型瞬时表达载体;转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬... 根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,克隆了家蚕丝素重链基因(Fib-H)启动子及其下游的信号肽序列(FibHS),将DsRed基因与信号肽序列融合构建了分泌型瞬时表达载体;转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed;家蚕注射载体后,可在丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed分泌到丝腺腔,推测所克隆的序列具有信号肽的功能。此外,本研究为家蚕丝腺生物反应器分泌表达外源基因的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 丝素重链启动子 信号肽 dsred 家蚕 BmN细胞 丝腺
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单体红色荧光蛋白基因DsRed2的克隆及其原核表达 被引量:1
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作者 康泽然 李鹏 +3 位作者 吴委林 孙云轩 朴世领 郑大浩 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期420-425,共6页
从原始质粒pDsRed2-1中分离红色荧光蛋白基因DsRed2、构建原核表达载体pGEX4T1-DsRed2,进行了原核表达。结果表明:目标DNA序列含有由678bp构成的开放阅读框(ORF),编码由225个氨基酸构成的蛋白(红色荧光蛋白,简称RFP2)。与参考... 从原始质粒pDsRed2-1中分离红色荧光蛋白基因DsRed2、构建原核表达载体pGEX4T1-DsRed2,进行了原核表达。结果表明:目标DNA序列含有由678bp构成的开放阅读框(ORF),编码由225个氨基酸构成的蛋白(红色荧光蛋白,简称RFP2)。与参考序列相比,目标DNA序列在其ORF内存在一个单碱基的同义突变,所编码的目的蛋白氨基酸序列不变。DsRed2基因在常用的表达菌株BL21(DE3)和克隆菌株DH5et中都能够表达出目的蛋白RFP2,使菌落呈现红色。在BL21(DE3)中,在1~5h内,随诱导时间的延长,RFP2的表达量迅速增加,此后增加不明显。在原核细胞中表达出的RFP2,大多以难溶性包涵体形式存在,仅少量溶于细胞质中,但都能正常显示出红色。RFP2为单体红色荧光蛋白,且在自然光下即可激发出红色荧光;DsRed2作为报告基因,可以非常简单、方便地区分出阳性和假阳性菌落。 展开更多
关键词 dsred2 单体红色荧光蛋白 原核表达 包涵体
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列当生防菌Br-2的DsRed红色荧光标记及定殖 被引量:2
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作者 王亚娇 纪莉景 +2 位作者 栗秋生 王连生 孔令晓 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期664-670,共7页
为探明生防菌Br-2在分枝列当体内及番茄根围的定殖能力,采用PEG-CaCl_2介导的原生质体转化体系将红色荧光蛋白基因DsRed转入到菌株Br-2中,并构建其生长曲线,测定其对分枝列当种子萌发的抑制率,通过共聚焦显微镜观察其在分枝列当茎内及... 为探明生防菌Br-2在分枝列当体内及番茄根围的定殖能力,采用PEG-CaCl_2介导的原生质体转化体系将红色荧光蛋白基因DsRed转入到菌株Br-2中,并构建其生长曲线,测定其对分枝列当种子萌发的抑制率,通过共聚焦显微镜观察其在分枝列当茎内及番茄根围的定殖情况。结果表明:通过原生质体转化体系得到了标记菌株Br-2-DsRed,继代培养5代后,其在共聚焦显微镜下仍可观察到亮红色荧光,经PCR检测带有DsRed基因,证明其稳定性好。标记菌株Br-2-DsRed与野生菌株Br-2的生长曲线基本一致,对分枝列当种子萌发的抑制率分别为75.86%和74.14%,无显著差异。显微观察发现,标记菌株Br-2-DsRed接种1 d后即能够侵染分枝列当的茎部表皮,3 d后主要分布在茎表皮和厚壁细胞间隙,5 d后侵染到厚壁细胞及维管束细胞内部并导致茎部腐烂;而标记菌株Br-2-DsRed不能侵染番茄根尖的内部,主要定殖在番茄根尖表面。 展开更多
关键词 列当生防菌 红色荧光蛋白 原生质体转化 定殖
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越南伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记及功能稳定性 被引量:1
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作者 刘敏敏 吴远征 +3 位作者 扈进冬 李纪顺 王燕 杨合同 《山东科学》 CAS 2023年第1期51-57,共7页
利用氨基纳米黏土介导的转化方法,应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中,采用细菌培养法、... 利用氨基纳米黏土介导的转化方法,应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中,采用细菌培养法、继代培养法和平板对峙培养法检测标记菌株的功能稳定性。通过氨基纳米黏土转化体系成功获得了荧光标记菌株B418-DsRed,与野生菌株B418相比,其生长曲线和形态学特征基本一致。继代培养10代后,标记菌株在共聚焦显微镜下呈现亮红色荧光,能够提取到外源质粒pGEX-4T-1-DsRed,并通过聚合酶链式反应扩增获得荧光基因序列DsRed,证明标记菌株具有较好的遗传稳定性。平板对峙培养试验显示,标记菌株B418-DsRed对尖孢镰孢菌和大丽轮枝菌抑制率分别为55.25%和67.55%,与野生菌株B418无显著性差异,表明外源质粒的导入未影响菌株的抑菌能力。以上结果表明通过氨基纳米黏土介导成功实现了伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记,构建的标记菌株B418-DsRed可用于该生防菌在植物根际的定殖及与病原菌的互作研究。 展开更多
关键词 越南伯克霍尔德氏菌 红色荧光蛋白 氨基纳米黏土 功能稳定性
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