文摘目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。
文摘为探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV-2)载体能否有效地转染神经干细胞(neural stem cell,NSC),本研究采用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP),以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。同时,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV-2对NSC存活、增殖、分化能力的影响。并利用流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSC的转染效率。结果显示,转染10d后各转染组可观察到NSC克隆球发出绿色荧光,起始荧光强度不一,同时荧光强度随时间的延长而逐渐增强。转染21d后荧光强度达高峰并维持在高水平。流式细胞仪检测结果表明:MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为26.34%、50.97%、56.36%,荧光指数(FI)分别为4.01、12.70、14.08。转染组和未转染组细胞培养7、14、21d时其细胞活力、增殖倍数、分化均无统计学差异。本实验初步证明rAAV-2能有效地转染NSC。