顺式串联双拷贝DuIFN—γ基因的真核表达

目的：以鸭γ－干扰素（DuIFN-γ)基因为目的基因，研究同一启动子调控下，不同拷贝数的目的基因的表达状况。方法：采用基因重组技术构建含DuIFN-γcDNA单拷贝和双拷贝重组质粒并转入真核细胞COS－7中进行表达。DuIFN-γ活性采用Griess试剂检测。结果：双拷贝重组质粒和单拷贝重组质粒50％最大活性稀释度分别为1：320和1：160。双拷贝重组质粒转染上清稀释10240倍后，仍保留DuIFN-γ活性，而单拷贝重组质粒转染上清经1280倍稀释后，即丧失活性。结论：在同一启动子作用下，顺式插入双拷贝目的基因可明显增强目的基因在真核细胞中的表达量。

IFN-γ基因对表达DHBV preS/S蛋白质的DNA疫苗诱生免疫应答的影响

目的 利用DHBV感染鸭模型 ,研究鸭IFN γ真核表达质粒作为免疫佐剂对DNA疫苗诱导免疫应答的影响和预防DHBV感染的作用。方法 用DuIFN γ真核表达质粒与DHBpreS SDNA疫苗共免疫 ,或用DHBpreS SDNA疫苗单独免疫正常幼鸭 ,检测经免疫前后鸭PBMC表达DuIFN γ的mRNA水平 (半定量竞争性RT PCR)、诱生的抗体水平 (ELISA)、病毒攻击免疫鸭后血清和肝脏中的病毒DNA变化 (斑点和Southern印迹核酸杂交 )。结果 IFN γ表达质粒作为免疫佐剂 ,可以增强DNA疫苗诱导的鸭PBMCIFN γ的mRNA表达水平。用大剂量病毒攻击免疫鸭的结果显示 ,用DuIFN γ表达质粒和DHBpreS SDNA疫苗共免疫鸭清除DHBV的速度 ,明显比仅用DHBpreS SDNA疫苗免疫鸭清除病毒的速度快 ,肝脏中DHBV总DNA和共价闭环DNA(cccDNA)的量也低于DHBpreS SDNA单独免疫组。结论 IFN γ真核表达质粒作为免疫调节佐剂在DNA免疫中具有潜在的应用价值。

外周血单个核细胞IFN-γ mRNA的测定及应用

目的 研究鸭IFN γ(DuIFN γ)在感染及控制病毒过程中的作用和机制。方法 基于β actin的高度保守序列设计引物 ,通过RT PCR方法获得了 β actin的部分cDNA为看家基因 ,然后构建DuIFN γ靶片段的竞争性内参照 ,建立检测DuIFN γ基因转录的半定量竞争性RT PCR方法。结果 建立了检测DuIFN γ基因转录的半定量竞争性RT PCR方法 ,并检测了在PHA刺激下鸭外周血单核细胞IFN γmRNA动态变化 ,结果表明PHA刺激 2 4～ 36h ,DuIFN γmRNA转录量最高。以此方法对用DHBVpreSDNA或与IFN γDNA共免疫DHBV感染鸭进行了测定 ,结果表明IFN γ表达质粒作为DNA免疫佐剂 ,可以增强宿主IFN γ的应答。结论 IFN γ表达质粒为DNA疫苗的有效佐剂。DuIFN γ基因转录的半定量竞争性RT PCR方法为研究鸭IFN γ在DHBV感染及清除中的作用和机制奠定了基础。