Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法(RT-nested-PCR),采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎(DVH)的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS。SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列，应用PrimerPrimier5．0软件，在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物，成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带，从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带，设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒，特异性好；分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此，该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列,设计一对特异性引物。通过RT-PCR的方法扩增DHV-Ⅰ(A66株)VP3基因并将其5′端起始处稀有密码子同义突变。用限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ消化VP3基因片段和表达载体pGEX-6p-1后构建重组表达质粒pGEX-VP3,转化E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明,VP3基因在大肠埃希菌中大量表达,表达产物的分子质量约为52 ku。Western blot检测表明,表达产物能与DHV-Ⅰ阳性血清发生反应,具有反应原性。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎研究进展

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭一种高度致死、高度传播性的病毒性传染病。该病以肝炎为主要特征,具有高发病率和高病死率。DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3个型之间无交叉保护作用。Ⅰ型DHV呈世界性分布,并常和其他病毒、细菌混合感染,严重影响了养鸭业,造成了巨大的经济损失。文章对Ⅰ型DVH病原学、致病机理、分子生物学诊断技术和防控等方面进行了综述。

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到了预期大小为699 bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-Ⅰ的相应基因序列比对分析,同源性均达90%以上,表明为DHV-Ⅰ的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明,最低RNA模板检出量为24 pg。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于I型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR快速检测鸭瘟病毒的研究

根据GenBank中鸭瘟病毒(DPV)UL6和UL7基因的保守序列,设计了一对特异性引物,扩增位于UL6和UL7基因第891～991位长度为101bp片断。以DPV标准强毒株DNA为模板,建立了SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒的方法,用该方法检测鸭瘟标准强毒、疫苗毒及野毒株均为阳性,检测其他受试的非鸭瘟病毒DNA均为阴性,对鸭瘟强毒和疫苗毒人工感染鸭胚尿囊液的检出率均为100%,对6个临床送检样本的检出率为6/6,与病毒分离鉴定结果一致;最小检出量为1.57×104拷贝/ul。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据Genebank中I型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列,设计合成了2对引物,以山东、江苏、广东、河南等地分离株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,均得到预期大小的目的片段,两对引物的检测结果一致。并对其中一种方法的敏感性、特异性进行了检测,结果表明本试验建立的用于I型鸭病毒性肝炎病毒诊断的RT-PCR方法具有较高的敏感性和特异性,最低RNA模板检出量为100pg,只能特异的检测出I型DHV,不能检出NDV、IBDV、DPV和GPV。因此,所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于鸭病毒性肝炎病毒的快速鉴别诊断。

Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒MY株的培育及实验研究

将Ⅰ型鸭肝炎分离株XC-1适应鸡胚,培育成1株毒力弱而稳定、免疫原性良好的鸭肝炎鸡胚化MY弱毒株。该毒株毒力为1011.40ELD50/0.1mL,1013.62TCID50/0.1mL;对雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代未见毒力返强;1日龄雏鸭用8,000 ELD50/0.1mL的MY株致弱毒腿部肌注0.2ml免疫后3d强毒原液0.5mL/只攻击,可产生2/5的保护,第6d-21d产生完全保护,免疫后第3d、5d、6d、7d、9d、14d、21d抗DHVⅠ的中和抗体滴度分别为10-1.38、10-1.55、10-1.64、10-1.65、10-1.68、10-1.8、10-1.89,表明MY是1株理想的鸡胚弱毒疫苗后备株;通过MY株的鸡胚的繁殖规律观察,确定该病毒的最佳收毒时间为接胚后的72h^84h,为疫苗生产条件的建立提供了依据。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)的主要结构蛋白VP1,根据GenBank已发表的DHAV-ⅠSH株VP1基因序列,设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP1,将其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定后,构建重组穿梭质粒rBacmid-VP1。在脂质体介导下将重组质粒rBacmid-VP1转染昆虫细胞Sf 9,制备含有DHAV-ⅠVP1基因的重组杆状病毒rBac-VP1。Western blot结果显示,表达的重组蛋白VP1大小约27 ku,能与DHAV-ⅠVP1多克隆抗体发生特异性反应;间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白VP1能与DHAV-Ⅰ全病毒阳性血清发生特异性反应,细胞内出现较强的荧光。以上结果表明,在昆虫细胞中成功表达了具有免疫原性的DHAV-Ⅰ主要结构蛋白VP1。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

SYB GRreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的建立与初步应用

目的:建立一种快速、特异的SYBR GreenⅠ实时PCR方法检测甲肝病毒。方法:对SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性。并用该方法对甲肝病毒毒株、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(1～6型)毒株、贝类水产品标本进行检测。结果:SYBR GreenⅠ实时PCR与传统RT-PCR检测甲肝病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2。该方法能特异检测出甲肝病毒,不能扩增脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(1～6型)毒株,对农贸市场40份贝类水产品进行甲肝病毒核酸检测,检出3份。结论:建立的SYBR GreenⅠ实时PCR方法用于甲肝病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于甲肝的病原学监测。

鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT—PCR诊断方法的建立

根据Genebank上发表的鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-1)的部分序列设计了1对引物D1/D2,通过对反应条件的优化,建立起了有效的鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT-PCR诊断方法。并应用此方法对近年在上海及周遍地区分离到的2株DHV-1分离毒进行了检测和测序鉴定,结果证实此株分离毒为DHV-1病毒。结果显示建立的DHV-1的PCR诊断方法具有快速、准确的优点。

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。

SMMC-7721肝癌细胞膜上β_2糖蛋白Ⅰ受体的表达

目的:研究β2糖蛋白I(β22GPI)与 SMMC-7721肝细胞膜的相互作用过程,探讨乙型肝炎病毒(HBV)嗜肝性的发生机制．方法:采用荧光显微镜及流式细胞仪分析的方法．检测SMMC-7721、HL-60及SGC-7901 三种细胞膜与FITC-β2GP I相结合的情况以及二者的结合特性．结果:仅SMMC-7721细胞膜表面附有大量荧光,其余2种细胞无此现象．加FITC-β2GP I 20 μL时,SMMC-772 1与FITC-β2GP I 的结合率为19％,明显高于FITC-β2GP I与 HL-60的结合率(1．7％)及与SGC-7901的结合率(1．9％)(P<0．01)．加FITC-β2GP I 50μL 时,SMMC-7721与FITC-β2GP I的结合率为 20．8％,与20 μL的结合率无差异(P>0．05),说明SMMC-7721与FITC-β2GP I的结合率不随 FITC-β2GP I量的增加而增高．结论:在SMMC-7721肝细胞膜表面存在能与人β2GP I特异结合的蛋白．

Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索

将Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株进行纯粹检验；以100ELD50 0．2mL／枚（含病毒3．0×10^5个拷贝）剂量经鸡胚尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每隔12h观察并采集鸡胚胚体和尿囊液样本，运用自行建立的检测DHV-1的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测MY株弱毒的鸡胚增殖规律．结果表明，该毒种符合我国的兽用生物制品规程，毒种纯粹；病毒接种后，鸡胚死亡时间主要集中在48-53h；病毒在感染后的12h，24h，36h，48h和53h时段，鸡胚尿囊液中病毒拷贝数为：3．28×10^2、5．28×10^3、7．01×10^3、3．31×10^5和4.42×10^5；鸡胚胚体病毒拷贝数为：8．46×10^3、1．91×10^6、3．41×10^6、1．36×10^7和1．03×10^7;显示，MY株弱毒经鸡胚尿囊腔接种鸡胚，病毒在胚体中的拷贝数在各时间均高于尿囊液中的拷贝数，且在48-53h达到高峰（1．36×10^7-1．03×10^7）．因此，用鸡胚繁殖MY株弱毒，应以收获鸡胚胚体为主要毒源，收毒时间以鸡胚尿囊腔接种后48～53h为佳．为运用MY株生产Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗奠定了基础．

36例乙型肝炎病人病毒核糖核酸、肌钙蛋白Ⅰ与心电图改变关系的探讨

目的:研究乙型肝炎(HB)病人血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)与心电图(ECG)改变三者的关系,探讨HBV对心肌损伤的机理。方法:收集36例HB的临床资料及ECG的变化,并检测血清HBV-DNA、cTn Ⅰ含量。结果:急性肝炎患者血清HBV-DNA含量明显高于慢性肝炎;各型肝炎cTn Ⅰ的阳性率不等,总阳性率为22.2%(8 36)。急性、慢性重度、慢性中度、肝硬化、慢性轻度的阳性率分别为50%(2/4)、25%(1/4)、23.4%(3、1 3)、14.2%、(1 7)、12.1%(1/8),急性肝炎明显高于其它各组(P<0.01)。慢性中度、莺度与慢性轻度、肝硬化之间也有显著差异(P<0.01)。慢性轻度与肝硬化之间、慢性中度与慢性重度之间无显著差异。HB病人ECG异常发生率为36.1%(13/36),4例急性肝炎患者均有过ECG改变,显著高于其它各组(P<0.01)。结论:1)cTn Ⅰ阳性与ECG异常表现并不一致,cTn Ⅰ可以作为判断HB心肌损伤的敏感和特异性指标;2)在HB急性期的心肌损伤可能是HBV直接作用,慢性HB心肌损伤是自身免疫作用的结果。

一株Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了研究Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)遗传变异情况,试验采用全基因组序列测定的方法对广东省佛山地区分离到的1株Ⅰ型鸭肝炎病毒进行分析研究。结果表明:不含poly(A)尾的DHV-Ⅰ基因组全长7 690 bp,只含有1个开放阅读框(ORF),编码2 249个氨基酸;将此病毒株与GenBank公布的其他DHV全基因序列进行序列分析,VP1蛋白变异最大,180～220位为高变区,与DHV-Ⅰ参考毒株核苷酸序列同源性在94.0%～97.4%之间,氨基酸序列同源性在97.5%～99.2%之间;对此病毒株进行遗传进化分析,与DHV-Ⅰ参考毒株处于同一分支,与韩国和中国台湾省新型鸭肝炎病毒处于不同分支。