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O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 张展 陈信全 +2 位作者 冯国金 黄慧贤 利光辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期601-607,共7页
为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定... 为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 塞内卡病毒 双重rt-qpcr方法 P3基因 VP2基因
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鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究 被引量:1
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作者 赵雪丽 闫若潜 +8 位作者 王华俊 王淑娟 马震原 谢彩华 柴茂 杨海波 王翠 刘影 王东方 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期165-173,共9页
建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性... 建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 rep基因 猪圆环病毒3型 cap基因 双重TaqMan MGB FQ-pcr
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肺炎克雷伯菌与链球菌双重PCR检测方法的构建 被引量:1
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作者 王一霖 王燕 +4 位作者 梁纤纤 郭明强 樊晓慧 夏俊 苏战强 《草食家畜》 2024年第3期51-59,共9页
【目的】旨在建立一种可同时检测肺炎克雷伯菌和链球菌的双重PCR检测方法。【方法】选取肺炎克雷伯菌KP-Khe基因和链球菌EF-Tu基因保守片段,分别合成2对特异性引物,优化双重PCR反应体系,摸索其特异性、最佳退火温度、引物浓度和细菌核... 【目的】旨在建立一种可同时检测肺炎克雷伯菌和链球菌的双重PCR检测方法。【方法】选取肺炎克雷伯菌KP-Khe基因和链球菌EF-Tu基因保守片段,分别合成2对特异性引物,优化双重PCR反应体系,摸索其特异性、最佳退火温度、引物浓度和细菌核酸浓度,并通过该方法对临床样品进行检测验证。【结果】该双重PCR检测方法可有效扩增出肺炎克雷伯菌和链球菌的489bp和197bp的特异性片段,最适退火温度为58℃、最适引物浓度为12ng/µL、最适模板浓度为3ng/µL。将该方法应用于临床对15份样品进行检测,其中2份样品检测出肺炎克雷伯菌呈阳性,1份样品检测出链球菌呈阳性,与分离鉴定结果一致。【结论】该研究建立的双重PCR技术,可为临床诊断肺炎克雷伯菌、链球菌及混合感染提供了一种便捷高效的检测方法,具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 链球菌 双重pcr
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猫冠状病毒和猫细小病毒双重荧光定量PCR方法的建立
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作者 郭存杰 王蕾 +3 位作者 毕振威 钱晶 张传美 谭业平 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期91-95,共5页
为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏... 为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性和重复性试验,探讨所建方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FCoV和FPV,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫轮状病毒、支原体、衣原体、波氏杆菌、犬腺病毒和犬副流感病毒等病原核酸无交叉反应,对FCoV和FPV检测限均为1 copies/μL;FCoV和FPV阳性参考质粒组间和组内重复试验变异系数均小于3%;对35份临床样本进行检测,发现建立的双重荧光定量PCR方法阳性检出率比普通PCR方法高。结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有灵敏、特异和稳定等优点,可用于临床FCoV和FPV感染的早期鉴别诊断。 展开更多
关键词 猫冠状病毒 猫细小病毒 双重荧光定量pcr
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非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用
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作者 刘影 闫若潜 +10 位作者 王东方 杨海波 赵美雪 宋丹 赵雪丽 谢彩华 王淑娟 马震原 柴茂 王翠 刘梅芬 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期118-130,共13页
建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应... 建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重FQ-pcr
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A duplex RT-PCR assay for detection of H9 subtype avian influenza viruses and infectious bronchitis viruses 被引量:3
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作者 WEI Yan-di GAO Wei-hua +5 位作者 SUN Hong-lei YU Chen-fang PEI Xing-yao SUN Yi-peng LIU Jin-hua PU Juan 《Journal of Integrative Agriculture》 SCIE CAS CSCD 2016年第9期2105-2113,共9页
H9 s ubtype avian influenza virus(AIV) and infectious bronchitis virus(IBV) are major pathogens circulating in poultry and have resulted in great economic losses due to respiratory disease and reduced egg producti... H9 s ubtype avian influenza virus(AIV) and infectious bronchitis virus(IBV) are major pathogens circulating in poultry and have resulted in great economic losses due to respiratory disease and reduced egg production. As similar symptoms are elicited by the two pathogens, it is difficult for their differential diagnosis. So far, no reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) assay has been found to differentiate between H9 AIV and IBV in one reaction. Therefore, developing a sensitive and specific method is of importance to simultaneously detect and differentiate H9 AIV and IBV. In this study, a duplex RT-PCR(d RT-PCR) was established. Two primer sets target the hemagglutinin(HA) gene of H9 AIV and the nucleocapsid(N) gene of IBV, respectively. Spec ific PCR products were obtained from all tested H9 AIVs and IBVs belonging to the major clades circulating in China, but not from AIVs of other subtypes or other infectious avian viruses. The sensitivity of the d RT-PCR assay corresponding to H9 AIV, IBV and mixture of H9 AIV and IBV were at a concentration of 1×10^1, 1.5×10^1 and 1.5×10^1 50% egg infective doses(EID_(50)) m L^–1, respectively. The concordance rates between the d RT-PCR and virus isolation were 99.1 and 98.2%, respectively, for detection of samples from H9N2 AIV or IBV infected chickens, while the concordance rate was 99.1% for detection of samples from H9N2 AIV and IBV co-infected chickens. Thus, the d RT-PCR assay reported herein is specific and sensitive, and suitable for the differential diagnosis of clinical infections and survei llance of H9 AIVs and IBVs. 展开更多
关键词 avian influenza viruses H9 subtype infectious bronchitis viruses duplex rt-pcr
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双重PCR区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌
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作者 潘斐 敖莉丝 +1 位作者 潘汝谦 纪春艳 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期913-919,共7页
黑腐病和基腐病是威胁花生生产的重要病害。两种病害在田间发病症状十分相似,凭症状区分诊断困难。本研究利用calmodulin(cmdA)基因序列设计特异性引物,通过优化反应体系和反应条件,针对花生黑腐病菌和基腐病菌进行了双重PCR的区分检测... 黑腐病和基腐病是威胁花生生产的重要病害。两种病害在田间发病症状十分相似,凭症状区分诊断困难。本研究利用calmodulin(cmdA)基因序列设计特异性引物,通过优化反应体系和反应条件,针对花生黑腐病菌和基腐病菌进行了双重PCR的区分检测。结果表明,在反应体系浓度为1.8×、引物浓度为0.2μmol/L、退火温度为62℃、反应循环数为37的条件下,可特异性地分别扩增出两条目的条带(274 bp和409 bp),检测灵敏限度为100 pg/μL。成功建立了可准确、快速区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR,可为准确诊断和及时防控花生两种易混淆的病害提供科学的参考。 展开更多
关键词 花生 黑腐病菌 基腐病菌 双重pcr
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miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用
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作者 胡舒啸 陈惠香 +5 位作者 胡胜 赵一霞 季安全 李洋 廉洁 孙启凡 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第3期706-715,共10页
目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于... 目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。 展开更多
关键词 法医遗传学 体液鉴别 双重实时荧光定量pcr MICRORNA
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日勾维多细菌源菌双重PCR快速检测方法建立
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作者 刘丰 邓源昌 +1 位作者 应国红 王晓炜 《日用化学工业(中英文)》 北大核心 2024年第1期45-50,共6页
建立日勾维多细菌源菌快速检测方法,快速有效地检出样品中的日勾维多细菌源菌。利用日勾维多细菌源菌的看家基因gyrB和ropB,设计2对特异性的扩增引物,以培养液作为DNA扩增模板,建立双重PCR快速检测方法,并通过优化扩增反应的退火温度,... 建立日勾维多细菌源菌快速检测方法,快速有效地检出样品中的日勾维多细菌源菌。利用日勾维多细菌源菌的看家基因gyrB和ropB,设计2对特异性的扩增引物,以培养液作为DNA扩增模板,建立双重PCR快速检测方法,并通过优化扩增反应的退火温度,提高双重PCR的特异性;利用引物gyrB-F/gyrB-R和ropB-F/ropB-R(insert)扩增4株日勾维多细菌源菌,可得到2条特异性的目标DNA条带,但非目标菌会出现非特异性DNA条带。优化后的退火温度为65℃,以4株日勾维多细菌源菌为DNA模板时,可扩增出特异性的目标DNA条带;以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌和洋葱伯克霍尔德菌为DNA模板时,均检测不到DNA条带。当样品中的日勾维多细菌源菌达到4.4 CFU/mL时,双重PCR即可高灵敏检出样品中的日勾维多细菌源菌。可用双重PCR方法快速检出沐浴露、洗发水等淋洗类化妆品中的日勾维多细菌源菌。 展开更多
关键词 化妆品 日勾维多细菌源菌 双重pcr 快速检测
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羊泰勒虫与嗜吞噬细胞无浆体双重PCR检测方法的建立
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作者 宁宇春 王圆赫 +2 位作者 郭祥杰 朱宏阳 田万年 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期110-114,共5页
为建立一种能快速对羊泰勒虫(ovine and caprine theileria)和嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytoph-ilum)同时进行检测的双重PCR方法。根据GenBank已报道的羊泰勒虫MPSP基因和羊嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因设计合成了2对特异性引物,通过... 为建立一种能快速对羊泰勒虫(ovine and caprine theileria)和嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytoph-ilum)同时进行检测的双重PCR方法。根据GenBank已报道的羊泰勒虫MPSP基因和羊嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因设计合成了2对特异性引物,通过条件优化,建立了双重PCR检测方法。双重PCR可特异扩增出羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体目的条带,片段大小分别为875bp和394bp。该方法具有较好的特异性,对羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的最低检出浓度为16fg/μL和1fg/μL。对采集的60份血液样本进行双重PCR检测,羊泰勒虫阳性率为46.67%(28/60),嗜吞噬细胞无浆体阳性率为13.33%(8/60),混合感染率为10%(6/60)。结果表明,双重PCR方法可用于羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的快速诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 双重pcr 羊泰勒虫 嗜吞噬细胞无浆体 主要表面蛋白 16S rRNA
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产气荚膜梭菌四环素耐药基因双重荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 欧兰欣 叶碧锦 +13 位作者 孙铭飞 戚南山 李娟 吕敏娜 林栩慧 蔡海明 胡俊菁 宋勇乐 陈祥杰 朱易斌 尹理君 张健騑 廖申权 张浩吉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4630-4637,共8页
旨在开发一种快速、灵敏的针对产气荚膜梭菌四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的双重荧光定量PCR检测方法,为快速检测产气荚膜梭菌四环素类抗生素耐药性提供新策略。本研究针对tetA(P)和tetB(P)的保守序列设计引物和探针,构建重组质粒,... 旨在开发一种快速、灵敏的针对产气荚膜梭菌四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的双重荧光定量PCR检测方法,为快速检测产气荚膜梭菌四环素类抗生素耐药性提供新策略。本研究针对tetA(P)和tetB(P)的保守序列设计引物和探针,构建重组质粒,对退火温度和体系进行优化,同时采用药敏纸片琼脂扩散法测定菌株对四环素类药物的敏感性加以验证。结果发现,优化后的反应程序为95℃30 s;95℃5 s,56℃30 s,共39个循环。使用该反应程序仅能扩增重组质粒,对照菌株无扩增曲线;组内变异系数小于1.3%,组间变异系数小于1.8%,重组质粒最低检测限度为102 copies·μL^(-1)。使用本方法对33份产气荚膜梭菌临床分离株样品进行耐药基因检测,同时进行药敏试验,发现本研究建立的检测方法对四环素耐药基因的检出率均为75.8%(25/33),且与药敏试验结果一致。综上,本研究建立了一种特异、敏感、重复性好的产气荚膜梭菌四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的双重荧光定量PCR检测方法。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 四环素 tetA(P) tetB(P) 双重荧光定量pcr
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柔嫩艾美耳球虫和肠致病性大肠杆菌双重PCR检测方法的建立及流行病学调查应用
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作者 罗小勇 杜鹏 +3 位作者 向万江 杨佳佳 陈影 王碧 《贵州农业科学》 CAS 2024年第6期78-84,共7页
【目的】建立可同时检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)和肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)的双重PCR检测方法,为临床E.tenella继发EPEC病的检测提供技术支持。【方法】基于E.tenella和EPEC(escV... 【目的】建立可同时检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)和肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)的双重PCR检测方法,为临床E.tenella继发EPEC病的检测提供技术支持。【方法】基于E.tenella和EPEC(escV)分别设计2条特异性引物,并通过退火温度、模板浓度和引物浓度等优化多重PCR的反应条件,建立2种病原体的双重PCR检测方法,并运用该方法检测贵州地区490份肉鸡、蛋鸡粪便样品,进行流行病学分析。【结果】该方法所需模板DNA的最低浓度组合为3.5ng/μL,最佳退火温度为62℃,最佳引物浓度组合为0.1 nmol/μL。流行病学调查显示,贵州毕节样本中E.tenella和EPEC的阳性率均为36.36%,混合感染阳性率9.09%;贵州黎平仅有EPEC感染,阳性率为23%;贵州习水样本中未检测出阳性,锦屏样本中E.tenella阳性率为11.11%,EPEC阳性率为22.22%,无混合感染。总样本中E.tenella、EPEC及2种混合感染的阳性率分别为10.20%、18.37%和2.04%。【结论】建立的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)和肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高和重复性好的优点。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 肠致病性大肠杆菌 双重pcr 流行病学 快速检测
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猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:15
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作者 闫若潜 安春霞 +4 位作者 刘淑敏 赵雪丽 郭小玲 赵明军 吴志明 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第9期38-42,共5页
为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PED... 为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10TCID50/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 二重rt-pcr 检测 建立 应用
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甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒双重RT-PCR检测方法的建立 被引量:9
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作者 许泳清 李华伟 +6 位作者 邱思鑫 刘中华 邱永祥 罗文彬 纪荣昌 汤浩 余华 《福建农业学报》 CAS 2014年第11期1114-1117,共4页
根据GenBank中公布的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因序列保守区域设计了2对特异性引物,通过RT-PCR反... 根据GenBank中公布的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因序列保守区域设计了2对特异性引物,通过RT-PCR反应程序的优化,建立了能同时检测SPFMV和SPCSV的双重PCR检测体系。该检测体系能够1次扩增出SPFMV和SPCSV的特异性片段,片段大小为461bp和304bp,测序结果表明,2种病毒序列与参考序列的同源性达93%以上。 展开更多
关键词 甘薯 甘薯羽状斑驳病毒 甘薯褪绿矮化病毒 双重rt-pcr
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鸭甲肝病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立 被引量:12
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作者 黄秋雪 汤承 +1 位作者 聂培婷 岳华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期120-123,共4页
为建立同时检测基因A型和C型鸭甲肝病毒(DHAV-A,DHAV-C)的双重RT-PCR方法,本实验根据GenBank中DHAV-A和DHAV-C全基因组序列,针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物,通过对反应体系和反应条件的优化及特异性、灵敏度评价... 为建立同时检测基因A型和C型鸭甲肝病毒(DHAV-A,DHAV-C)的双重RT-PCR方法,本实验根据GenBank中DHAV-A和DHAV-C全基因组序列,针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物,通过对反应体系和反应条件的优化及特异性、灵敏度评价,建立了检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法。该方法能够分别从DHAV-A、DHAV-C阳性样本中扩增出DHAV-A(259 bp)和DHAV-C(194 bp)的特异片段,而不与其它被检的无关病原发生非特异反应;对DHAV-A和DHAV-C的最低检出限分别为4.98×104拷贝/μL、1.68×104拷贝/μL;对2009年8月至2011年7月送检病料检出DHAV-A和DHAV-C的阳性率分别为20%(14/70)、70%(49/70);随机抽取的DHAV-C PCR阳性样本的病毒分离结果与双重RT-PCR检测结果的符合率为100%(16/16)。本研究结果显示,建立的双重RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于临床DHAV的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 鸭甲肝炎病毒 基因A型 基因C型 双重rt-pcr 鉴别诊断
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鸭坦布苏病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测方法的建立 被引量:6
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作者 张艳芳 谢芝勋 +6 位作者 谢丽基 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 范晴 罗思思 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期314-317,共4页
【目的】建立可同时检测鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)与鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)的二重RT-PCR,为有效防控DTMUV与DPV提供技术支撑。【方法】根据GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列,设计合成两对引物,优... 【目的】建立可同时检测鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)与鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)的二重RT-PCR,为有效防控DTMUV与DPV提供技术支撑。【方法】根据GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列,设计合成两对引物,优化反应体系条件,并通过特异性、敏感性试验评价建立的二重RT-PCR。【结果】优化后的二重RT-PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5μL,其中DTMUV上、下引物各0.5μL,DPV上、下引物各0.5μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足至25.0μL;最佳反应程序:95℃预变性5 min;95℃1 min,54.4℃1 min,72℃1 min,进行35个循环;72℃延伸10 min。该方法对DTMUV与DPV的检测敏感性分别达500和600 fg,但对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合症病毒等病原体不敏感。【结论】建立的二重RT-PCR可用于DTMUV与DPV感染的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒 鸭瘟病毒 二重rt-pcr 特异性 敏感性
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禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法的建立 被引量:6
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作者 袁万哲 邹云婧 +4 位作者 孙继国 陈立功 刘静 王庚南 刘聚祥 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期88-91,共4页
根据GenBank登录的禽流感病毒(AIV)M1基因与新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列,设计用于扩增AIV与NDV的RT-PCR引物,建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对AIV与NDV的最低核酸检出量分别为38和27 pg,可... 根据GenBank登录的禽流感病毒(AIV)M1基因与新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列,设计用于扩增AIV与NDV的RT-PCR引物,建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对AIV与NDV的最低核酸检出量分别为38和27 pg,可同时扩增出428 bp(AIV)与297 bp(NDV)的特异性片段,而对传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒与鸭肝炎病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于2种病毒病的临床快速检测与流行病学调查。 展开更多
关键词 禽流感病毒 新城疫病毒 二重rt-pcr 检测
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甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和矮化退绿病毒(SPCSV)的双重RT-PCR检测技术体系构建 被引量:6
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作者 黄广学 孟利前 +3 位作者 朱建晨 张进 李庞博 肖海峻 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期724-729,共6页
在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种... 在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。 展开更多
关键词 甘薯 羽状斑驳病毒 矮化退绿病毒 双重rt-pcr 检测技术
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猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立 被引量:6
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作者 郑世民 周首龙 +3 位作者 赵良友 刘超男 高雪丽 吕晓萍 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期57-60,90,共5页
为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测方法,参照GenBank已发表序列,根据TGEV和PEDV的S蛋白基因结构各设计1套特异性通用引物,扩增目的带分别为426和583 bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外光下于500 bp上... 为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测方法,参照GenBank已发表序列,根据TGEV和PEDV的S蛋白基因结构各设计1套特异性通用引物,扩增目的带分别为426和583 bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外光下于500 bp上、下各有一条电泳带,达到区分和鉴别目的。经优化确立最佳反应体系:引物、MgCl2和dNTP浓度分别为8、9和14μmol·L-1,退火温度54℃。该方法在捕获信息和复杂基因分析方面具有快速、敏感、特异、低成本等优点,可为TGEV和PEDV检测及TGE和PED流行病学调查等提供技术支持。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 反转录聚合酶链式反应 反应条件
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高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:8
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作者 安春霞 闫若潜 +4 位作者 吴志明 赵明军 赵雪丽 王东方 刘淑敏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第5期66-70,共5页
为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2)和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以H... 为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2)和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重rt-pcr 检测 建立 应用
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