补肾活血组方对心肌梗死后心衰大鼠心肌组织β-catenin、Dvl1蛋白及Axin2、Cyclin D1、KV4.3mRNA的影响

目的观察补肾活血组方对心肌梗死(心梗)后心力衰竭大鼠心肌组织β-连锁蛋白(β-catenin)、散乱蛋白1(Dishevelled1,Dvl1)及轴抑制蛋白2(Axin2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、电压门控钾通道蛋白4.3(voltagegated K+channel4.3,KV4.3)mRNA的影响。方法将13周龄雄性60只SD大鼠随机分为空白组15只和实验组45只。实验组大鼠通过结扎冠脉左前降支联合力竭式游泳、饥饿,建立心梗后心衰模型。造模成功的大鼠随机分3组,即模型组、赖诺普利组及补肾活血组。赖诺普利组灌胃赖诺普利混悬液1.5 mg/kg,补肾活血组灌胃补肾活血方熬制汤剂9.2 mg/kg,空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水,各组均2次/d。灌胃4周后,心脏超声检测左室收缩末内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒张末内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、射血分数(ejection fraction,EF)及左室短轴缩短分数(shortening fraction,FS),酶联免疫吸附法测定血清N末端B型利钠肽前体(N-terminal pro brain natriuretic peptide,NT-proBNP)、Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、Dickkopf-1(DKK1)、分泌性FZD相关蛋白1(secreted Frizzled-related proteins,sFRP1)、Wnt抑制蛋白1(Wnt inhibitory protein,WIF1)含量,免疫组化法检测大鼠心肌β-catenin、Dvl1表达,反转录聚合酶链式反应法检测Axin2、Cyclin D1、KV4.3 mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,EF、FS降低,血清NT-proBNP、DKK1、sFRP1、WIF1含量和心肌组织β-catenin、Dvl1蛋白及Cyclin D1、KV4.3mRNA表达升高(P<0.05),血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11及心肌组织Axin2mRNA表达降低(P<0.05)。与模型组比较,赖诺普利组和补肾活血组大鼠LVEDD、LVESD降低,EF、FS升高,血清NT-proBNP、DKK1、sFRP1、WIF1含量和心肌组织β-catenin、Dvl1蛋白及Cyclin D1、KV4.3mRNA表达降低(P<0.05),血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11及心肌组织Axin2mRNA表达升高(P<0.05)。结论补肾活血组方可能通过下调心梗后心衰大鼠β-catenin、Dvl1蛋白和Cyclin D1、KV4.3mRNA及DKK1、sFRP1、WIF1表达,上调Axin2mRNA及Wnt3a、Wnt5a、Wnt11表达,改善心功能,延缓心室重构,防止心衰发展。

丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠海马区神经干细胞增殖及Frizzled1、Dvl1、CyclinD1表达的影响

目的:探讨丹龙醒脑方对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠海马区神经干细胞增殖,以及Frizzled1、Dvl1、Cyclin D1表达的影响。方法:将80只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组、丹龙醒脑方7.4g/kg组和丹龙醒脑方14.8g/kg组,采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,再灌注1d、3d和7d采用改良m-NSS法进行神经功能缺损评分,7d后取大鼠缺血侧海马组织,采用免疫荧光法检测海马区Brdu阳性细胞率;采用RT-q PCR法、Western Blot法分别检测Frizzled1、Dvl1、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达。结果:1再灌注1d,与假手术组比较,其余各组神经功能缺损评分明显升高,而各组间差异无统计学意义;再灌注3d、7d,与模型组比较,依达拉奉组、丹龙醒脑方7.4g/kg组、丹龙醒脑方14.8g/kg组评分明显降低。2与假手术组比较,各组Brdu阳性细胞率增大,Frizzled1、Dvl1、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达明显增强;与模型组比较,依达拉奉组、丹龙醒脑方7.4g/kg组、丹龙醒脑方14.8g/kg组Brdu阳性细胞率增大,Frizzled1、Dvl1、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达明显增强。结论:丹龙醒脑方能改善神经缺损症状,促进脑缺血后海马区NSCs增殖,其机制可能与通过上调缺血再灌注后海马区Frizzled1、Dvl1表达水平,从而促进Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因Cyclin D1的表达水平有关。

Dvl1及其突变体腺病毒载体的构建与在MSCs中表达鉴定

Dvl1及其结构缺失突变体ΔDIX(dsh and axin)和ΔDEP(dsh,Egl-10 and pleckstrin)腺病毒载体的构建并验证其在MSCs(mesenchymal stem cells)中的表达情况。将目的基因定向克隆至pAdTrack-CMV穿梭载体上,并经PmeⅠ线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组,获得重组腺病毒载体,在QBI-293A细胞中包装及扩增,实时荧光定量PCR和Western bolt验证Dvl1在MSCs中的表达情况。经PCR、PacⅠ单酶切鉴定及测序分析,成功构建Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,目的基因序列与GenBank报道一致,并选出150 MOI为最适感染MSCs的感染复数,成功构建了Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,并获得高滴度的病毒子,qPCR和Western blot证实Dvl1在MSCs中高表达并增加了β-catenin在细胞中的累积,为进一步研究Dvl1在MSCs迁移过程的作用奠定了基础。

金郁欢汤剂灌胃对抑郁症小鼠抑郁样行为的改善作用及其机制

目的观察金郁欢汤剂灌胃对抑郁症小鼠抑郁样行为的改善作用,并探讨其机制。方法60只ICR小鼠随机分为control组、model组、JYH-L组(金郁欢低剂量)、JYH-H组(金郁欢高剂量)、fluoxetine组(氟西汀),每组12只,其中model组、JYH-L组、JYH-H组、fluoxetine组通过CMUS法建立小鼠抑郁症模型。造模完成后,JYH-L组小鼠给予0.2 g/kg金郁欢汤剂灌胃,JYH-H组给予0.8 g/kg金郁欢汤剂灌胃,fluoxetine组小鼠给予氟西汀悬浮液灌胃,control组和model组小鼠同期等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续3周。采用糖水偏嗜实验观察各组小鼠抑郁样行为,以糖水偏嗜度表示。采用Nissl染色法观察小鼠海马区神经细胞形态、尼氏小体染色情况,使用JD-801形态学图像分析系统检测各组小鼠海马CA1区尼氏小体积分光密度(IOD)。采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠海马组织中散乱蛋白1(Dvl1)mRNA,采用Western Blotting法检测各组小鼠海马组织中Dvl1蛋白。结果control组、JYH-L组、JYH-H组、fluoxetine组小鼠糖水偏嗜度均高于model组(P均<0.05),JYH-H组、fluoxetine组小鼠糖水偏嗜度均高于JYH-L组(P均<0.05)。model组、JYH-L组神经细胞排列松散或缺失,尼氏小体被轻微染色;JYH-H组与fluoxetine组海马区神经元细胞排列的更密集、更整齐,神经细胞无核固缩深染现象,尼氏小体染色加深。model组小鼠海马CA1区尼氏小体IOD值低于control组(P<0.05),JYH-H组、fluoxetine组小鼠海马CA1区尼氏小体IOD值均高于model组、JYH-L组(P均<0.05)。model组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA和蛋白相对表达量均低于control组(P均<0.05),JYH-H组、fluoxetine组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA和蛋白相对表达量均高于model组、JYH-L组(P均<0.05)。结论高剂量(0.8 g/kg)金郁欢汤剂灌胃可改善抑郁症小鼠的抑郁样行为,金郁欢汤剂改善抑郁症小鼠抑郁样行为的作用机制可能与其有效成分可上调海马组织中Dvl1的表达水平有关。