CyclinE/CDK2及p27在胃癌细胞周期G_1/S调控中的研究

目的探讨胃癌组织中Cyclin E/CDK2和p27蛋白表达及细胞增殖与胃癌发生及发展的关系。方法采用流式细胞术检测Cyclin E/CDK2及p27蛋白在胃癌组织及正常胃壁组织细胞中的表达,结合患者的年龄、性别以及肿瘤细胞分化程度、癌组织浸润深度及有无淋巴结转移等临床病理因素进行综合分析。结果胃癌组织及正常胃组织细胞增殖指数分别为(40.62±5.07)%和(24.99±3.11)%,二者比较有显著性差异(P<0.01);FCM检测胃癌组织及正常胃组织细胞中Cyclin E蛋白表达荧光强度分别为(482.67±19.45)A.U.和(442.46±20.49)A.U.,CDK2蛋白表达荧光强度分别为(469.04±21.62)A.U.和(436.64±11.24)A.U.,p27蛋白表达A.U分别为(449.10±19.98)A.U.和(502.17±18.78)A.U.,二者比较均有显著性差异(P<0.01)。结论胃癌具有旺盛的增殖能力。Cyclin E、CDK2及p27蛋白的异常表达引起了细胞异常增殖,从而引起早期胃癌的发生。联合检测Cyclin E、CDK2及p27蛋白的表达可为临床上胃癌早期诊断提供实验依据,对于提高临床上胃癌早期诊断的准确率具有重要的意义。

血管内皮生长因子及其受体与Cyclin E-CDK2在肝癌发生发展过程中的表达变化

目的通过观察血管内皮生长因子(VEGF)及其受体和细胞周期蛋白E(Cyclin E)在肝癌模型大鼠肝脏中表达情况,探讨VEGF与细胞周期相关蛋白在肝癌发生发展过程中的作用。方法建立诱发性肝癌模型,采用酶联免疫吸附试验检测血清中VEGF量的变化,免疫组化技术检测VEGFR1、Cyclin E和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)的表达情况。结果血清中的VEGF含量在对照组中最低,在实验组中逐渐增多,以癌变期含量最高。VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表达的平均光密度值均随着肝癌的发生发展有增高的趋势,大鼠血清中的VEGF量与肝脏组织中VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表达的平均光密度值随着肝癌的发生发展呈正相关(r=0.834,F=42.1274,P<0.05)。结论 VEGF及其受体VEGFR1在肝癌发生发展中异常表达,促进肝癌的发生发展,可能与Cyclin E、CDK2细胞周期蛋白异常表达有关。

中药胃康宁对胃癌细胞周期因子Cyclin E、CDK2和p27表达的影响

目的：观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞Cyclin E、CDK2（Cyclin dependant kinase 2,CDK2）和p27mRNA及其蛋白表达的作用.方法：分别以高、中、低不同剂量的胃康宁制剂对Wistar雄性大鼠进行灌胃,制备含药血清,然后分别用不同剂量组含药血清培养胃癌细胞,采用免疫组织化学SABC法检测各组胃癌细胞中CyclinE、CDK2和p27蛋白的表达,RT-PCR法检测各组胃癌细胞中Cyclin E、CDK2和p27 mRNA的表达.结果：免疫组化法结果显示,胃康宁高、中、低剂量组Cyclin E和CDK2灰度值均有明显升高,与空白对照组比较,P＜0.05～0.01,而p27灰度值则显著降低（P＜0.05～0.01）;RT-PCR结果显示,与空白对照组比较,胃康宁低、中、高剂量组均能明显降低Cyclin E和CDK2 OPTDI值（P＜0.05～0.01）.同时,还能升高p27 OPTDI值（P＜0.05～0.01）.结论：中药胃康宁可抑制胃癌细胞周期因子Cyclin E、CDK2及其mRNA的表达,促进细胞周期抑制因子p27及其mRNA的表达,这可能是胃康宁抑制胃癌细胞生长的机制之一.

降钙素基因相关肽对大鼠血管平滑肌细胞CDK2和Cyclin E的影响

目的:研究降钙素基因相关肽(CGRP)对大鼠血管平滑肌细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)和细胞周期蛋白E(Cyclin E)的影响,为阐明CGRP抑制血管平滑肌细胞增殖的细胞周期机制提供实验依据。方法:培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,分别用CGRP或/和10%FBS处理细胞。噻唑蓝比色法(MTT)观察CGRP对10%FBS诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞周期;Western blot检测CDK2和Cyclin E的表达。结果:CGRP能抑制10%FBS诱导的血管平滑肌细胞增殖,升高G0/G1期细胞百分比,降低S+G2+M期细胞百分比,抑制细胞内CDK2和Cyclin E表达。结论:CGRP能通过阻滞细胞周期由G0/G1期进入S期而抑制血管平滑肌细胞增殖,其作用机制可能与降低CDK2和Cyclin E表达有关。

VES抑制Raji细胞增殖中对CDK2和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

目的 比较观察维生素E琥珀酸酯 (VES)和维生素E(VE)对人单核细胞白血病Raji细胞的抗增殖作用及对细胞周期素依赖性激酶 2 (CDK2 ) ,细胞凋亡相关蛋白Bcl- 2、Bax的影响。方法 应用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫细胞化学染色等技术方法 ,体外观察VES和VE对Raji细胞的作用。结果 VES和VE对Raji细胞均有程度不一的生长抑制作用 ,2 0 μg/mlVES对Raji细胞的生长抑制在 72h即达 10 0 % ,而 2 0 μg/mlVE的抑制率仅与 5 μg/mlVES的接近。VES较强的生长抑制作用与诱发细胞凋亡的明显增加同步发生 ,具有剂量效应和时间效应关系 ,同时VES作用后 ,细胞内CDK2蛋白 ,Bcl- 2蛋白表达下降 ,Bax蛋白表达增加。结论 VES通过影响细胞周期调控因子CDK2 ,细胞凋亡相关蛋白Bcl- 2。

细胞周期相关蛋白cyclin E、cdk2和p27^(kip1)在垂体腺瘤中的表达

目的观察细胞周期相关蛋白cyclin E、cdk2和p27kip1在垂体腺瘤中的表达情况,探讨其与垂体腺瘤临床生物学行为的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测37例非侵袭性垂体腺瘤和21例侵袭性垂体腺瘤组织中cyclin E、cdk2和p27kip1蛋白的表达情况。结果在侵袭性垂体腺瘤中cyclin E和cdk2的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤(均P<0.01),p27kip1的表达明显低于非侵袭性垂体腺瘤(P<0.01);cyclin E与cdk2在垂体腺瘤中的表达呈正相关(r=1,P<0.01),两者与p27kip1的表达呈负相关(均r=-1,P<0.01);cyclin E和cdk2的表达与垂体腺瘤的侵袭性呈正相关(r=0.685,r=0.667,均P<0.01),而p27kip1的表达与垂体腺瘤的侵袭性呈负相关(r=0.659,P<0.01)。结论cyclin E、cdk2及p27kip1的表达情况可以作为判断垂体腺瘤的侵袭性和预后的指标。

CyclinE和cdk2在眼睑基底细胞癌组织中的表达及其意义

目的探讨CyclinE和cdk2在眼睑基底细胞癌组织中的表达及其意义。方法收集武汉市中心医院和武汉大学人民医院病理科2002-2009年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)标本共20例,另取癌周围组织5例作对照。采用免疫组织化学方法观察各组细胞内CyclinE和cdk2表达。利用HPIAS-2000图像分析系统测定CyclinE和cdk2在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果眼睑基底细胞癌组织中CyclinE和cdk2呈高表达;癌旁组织中CyclinE和cdk2呈低表达。图像分析结果显示:眼睑基底细胞癌组织与癌旁组织之间CyclinE和cdk2的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)。结论 CyclinE和cdk2的高表达,在眼睑基底细胞癌的发生、发展过程中起了重要作用,两者共同表达对于术后病人监测及治疗方案的制定具有指导意义。

不同病变胆囊组织中P27^(kip1)、CDK2、Cyclin E的表达及相关性研究

目的通过对胆囊结石、胆囊腺瘤性息肉及胆囊癌组织中细胞周期蛋白激酶抑制蛋白P27kip1、细胞周期蛋白依赖激酶CDK2、细胞周期素CyclinE的表达及相关性研究,分析在3种胆囊病变组织中的表达与病理的关系,以探讨其与胆囊癌的发生、发展有关的可能因素。方法应用免疫组织化学的方法分析人类3组胆囊组织中的P27kip1、CDK2、CyclinE的表达。结果P27kip1在胆囊癌的表达与CDK2的表达呈显著负相关(r=-0.949,P<0.05);CDK2与CyclinE的表达呈显著正相关(r=0.908,P<0.01)。胆囊癌中P27kip1的表达与Nevin病理分期呈显著负相关(r=-0.558,<0.01),而与患者的性别、年龄、分化及病理类型无明显关系(PP>0.05)P27kip1在胆囊癌与胆囊结石之间的表达差异有显著性(P<0.01),胆囊结石与胆囊息肉之间的表达差异也有显著性(P<0.01);CDK2、CyclinE在胆囊癌与胆囊结石的表达差异有显著性(P<0.01),胆囊结石与胆囊息肉之间的表达差异也有显著性(P<0.05)。结论胆囊癌中P27kip1、CDK2、CyclinE基因出现异常表达,P27kip1的表达抑制及CDK2、CyclinE的过度表达在胆囊癌的发生、发展过程中可能起促进作用。P27kip1、CDK2、CyclinE并不能作为预测肿瘤发生,诊断早期肿瘤理想的指标;P27kip1的低表达是胆囊癌预后不良的预测指标之一,CDK2。

CyclinE,CDK2,Ki-67在白血病中的表达及其临床意义

的 :探讨白血病细胞周期素E(cyclinE)、细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2 )、细胞增殖相关抗原(Ki 6 7)在白血病中的表达及其临床意义。方法 :应用免疫组织化学S P法检测 5 0例白血病病人骨髓 (急性 4 0例 ,慢性 10例 )cyclinE、CDK2和Ki 6 7的表达情况。 结果 :cyclinE阳性表达率 38 0 % ,CDK2阳性表达率 6 4 0 % ,均明显高于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ;Ki 6 7阳性表达率 16 0 % ,与正常对照组比较无显著差异 (P >0 .0 5 )。cyclinE表达与CDK2表达呈密切正相关 (P<0 .0 5 ) ;CDK2表达与Ki 6 7表达密切正相关 (P<0 .0 5 )。cyclinE和CDK2共同阳性表达者复发率明显增高。结论 :cyclinE和CDK2的异常表达在白血病发生发展和复发过程中起重要作用 ,其表达水平对判断疾病的预后和疗效有一定价值。

抑制PKCα对乳腺癌细胞特性及cyclin E和CDK2基因表达的影响

将构建的表达PKC_α反义RNA的质粒,转入人乳腺癌细胞Bcap-37中,通过筛选与检测获得PKC_α表达受到抑制的细胞。随后分析了细胞生长的血清依赖性、软琼脂成集落和致瘤性的变化,以及cyclin E和CDK2基因表达所受到的影响。结果显示PKC_α表达受到抑制后,乳腺癌细胞生长的血清依赖性增加,软琼脂成集落能力下降,细胞致瘤性被强烈抑制,说明PKC_α表达下降或活性降低伴随着乳腺肿瘤细胞恶性程度的减弱。同时,结果还表明PKC_α表达受到抑制后,导致细胞周期调控系统中的cyclin E及CDK2表达水平下降,说明PKC_α参与的信号转导系统与cyclin/CDK参与的细胞周期调控系统在功能上有着较为密切的联系。

ECRG2基因缺失通过p53途径导致中心体过度复制

目的探讨ECRG2基因调控中心体复制的分子机制。方法采用质谱法筛选ECRG2基因作用伙伴;采用免疫共沉淀法鉴定ECRG2与p53发生相互作用的位点;采用Western印迹法检测p53转录活性;采用免疫荧光技术观察ECRG2基因对p53中心体定位能力的影响。结果结果显示p53是ECRG2基因的一个新的作用伙伴。ECRG2基因通过其N端20个肽与p53发生相互作用,通过p53参与中心体复制。ECRG2基因缺失不但促进p53蛋白泛素化降解程度,降低p21蛋白活性,提高cyclinE/CDK2活性,从而启动了中心体过度复制,而且使p53蛋白无法定位于中心体,丧失了对中心体再复制的抑制作用。结论ECRG2基因通过p53参与中心体复制,一方面,ECRG2通过p53/p21/cyclin E/CDK2途径调控中心体复制;另一方面,ECRG2也可影响p53中心体定位能力,参与p53对中心体再复制的抑制作用。

DNA损伤反应中细胞周期检查点蛋白p27^(Kip1)表达及其调控机制

为了研究DNA损伤反应中p2 7Kip1的表达及其调控机制 ,应用免疫印迹的实验结果表明 :10Gy 60 Coγ射线照射后 3h ,HeLa细胞中p2 7Kip1蛋白水平开始下降并持续到 2 4h ,进而失去它对CDKs的抑制功能 .Northern印迹结果显示 ,电离辐射 (IR)对p2 7Kip1mRNA表达水平无明显影响 ,说明电离辐射诱导p2 7Kip1表达水平的降低主要与蛋白质降解相关 ,但其具体的调控机制还不清楚 .已知在G1—S期p2 7Kip1蛋白的降低主要依赖细胞周期蛋白E Cdk2激酶将其磷酸化后的泛素化蛋白酶体途径 (ubiquitin proteasomepathway) .酶动力学研究结果揭示 :电离辐射后细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性增高 ,12h细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性达到最大 .当在照前用细胞周期蛋白E Cdk2抑制剂olomoucine (10 μmol L)抑制细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性时 ,p2 7Kip1蛋白表达水平增加 .此外 ,还观察到电离辐射可诱导p2 7Kip1泛素化水平的增高 ,而在使用蛋白酶体抑制剂MG 132 (5 μmol L)处理HeLa细胞后 ,可抑制辐射诱导p2 7Kip1蛋白水平的下调 .研究结果提示 :泛素化蛋白酶体途径参与了辐射诱导P2 7Kip1蛋白表达下调的降解机制 .

细胞周期蛋白E及相关因子表达与肾癌发生、侵袭及转移的相关性研究

目的探讨肾癌细胞周期蛋白E(cyclinE)、周期依赖性激酶2(CDK2)和周期依赖性激酶抑制因子P27的表达状况及其意义。方法应用免疫组化SP法及RT-PCR检测37例肾癌组织、13例癌周正常肾组织中cyclinE、CDK2和P27蛋白及mRNA表达。并将上述指标与临床病理特征进行统计学分析。结果肾癌组织中cyclinE、CDK2阳性表达率分别为51.4%、43.2%,明显高于癌旁正常肾组织(P<0.05),并且随肿瘤分级及分期的升高、肿瘤转移而升高;两者mRNA含量变化同蛋白表达水平相符;相反,P27在肾癌和癌旁正常肾组织中表达量分别为48.6%、69.2%,二者差异显著(P<0.05),P27表达随肿瘤分级及分期升高、肿瘤的远位转移出现降低趋势。结论cyclinE、CDK2、P27参与了肿瘤形成及侵袭过程,是反映肾癌生物学特征有价值的标志物。

VES体外抑制Raji细胞增殖及机制的初步研究

目的 观察维生素E琥珀酸酯 (VES)体外对人单核细胞白血病Raji细胞的抗增殖作用及对细胞周期和细胞周期素依赖性激酶 2 (CDK2 )的影响。方法 应用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫细胞化学染色等技术方法 ,体外观察VES对Raji细胞的作用。结果 VES对Raji细胞的生长抑制作用与诱发细胞凋亡的明显增加同步发生 ,具有剂量效应和时间效应关系 ,同时VES作用后 ,细胞内CDK2蛋白表达下降 ,细胞周期发生变化 ,细胞阻滞于G1期。结论 VES通过影响细胞周期调控因子CDK2的表达从而干扰细胞周期可能是其抗肿瘤的途径之一。

高表达p21增加5-Fu对胃癌细胞的杀伤作用及机制

目的:p21是一种重要的细胞周期负性调控因子,目前其在胃癌化疗中的作用上不清楚.本课题主要观察p21蛋白转染胃癌细胞后,研究其对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)作用于胃癌细胞的敏感性影响及其可能的作用机制.方法:采用脂质体转染技术改变人胃癌细胞BGC823、SGC7901中p21蛋白变化,应用免疫印迹鉴定p21蛋白表达;CCK8比色法检测p21蛋白转染后BGC823、SGC7901细胞株对5-Fu敏感性的变化;采用流式细胞术分析细胞周期分布.结果:将p21质粒转染胃癌细胞后,细胞中p21蛋白表达量明显增高,与空载对照组比较具有统计学意义(P<0.05).p21高表达的胃癌细胞株对5-Fu敏感性明显增强,与空载对照组、阴性对照组比较,均具有统计学意义(P<0.01).p21高表达的细胞株处于G0/G1期比例明显增加,而S、G2/M期细胞比例明显减少;计算出细胞增殖指数(proliferation index,pI),与空载对照组、阴性对照组比较,均具有统计学意义(P<0.01).同时p21下游的周期蛋白依赖性激酶蛋白CDK2、Cyclin E均明显降低,与空载对照组、阴性对照组比较,均具有统计学意义(P<0.01).结论:p21蛋白能增加胃癌细胞珠对5-Fu的敏感性,其作用可能是通过使细胞周期发生G0/G1期阻滞及下调CDK2、Cyclin E的表达来实现的.

赫赛汀及9-顺式视黄酸对乳腺癌联合抑制作用

目的探讨赫赛汀联合9-顺式视黄酸对ErbB2阳性乳腺癌细胞周期进程及分布的影响及其相应的分子机制。方法利用流式细胞仪检测经赫赛汀、9-顺式视黄酸单独和联合作用后,癌基因(ErbB2/neu)阳性的MDA-MB-453乳腺癌细胞周期进程和分布的变化。在此基础上,利用免疫印记和半定量PCR法对CDK2、CyclinE、P27的表达进行检测,同时利用免疫沉淀法检测CyclinE/CDK2结合力的变化。结果与对照组比较,一定剂量的赫赛汀和9-顺式视黄酸可将MDA-MB-453细胞的周期进程阻遏于G0/G1期从而抑制其增殖活性。经2者联合作用后,CyclinE、CDK2的表达较对照组均有所下降,其中以CDK2的变化最为明显,而P27蛋白表达则明显升高。同时,2者联合作用还能有效降低CyclinE/CDK2的结合能力。结论赫赛汀和9-顺式视黄酸可在体外分别通过改变CyclinE、CDK2和P27的表达和活性起到协同抑制HrbB2/neu阳性乳腺癌的目的。

沉默CACUL1表达对食管癌细胞增殖的影响及其机制

目的探讨沉默CACUL1表达对食管癌细胞增殖的影响及机制,为食管癌的基因治疗提供实验依据。方法合成CACUL1 siRNA,转染EC109细胞,实时定量PCR检测转染CACUL1 siRNA前后CACUL1 mRNA表达变化,MTT法检测EC109细胞增殖能力,FCM检测细胞周期和凋亡,Western blot法分析CACUL1 siRNA对CDK2-Cyclin A/E蛋白表达的影响。结果通过转染CACUL1 siRNA沉默CACUL1,转染后EC109细胞中CACUL1 mRNA和蛋白表达量均较转染前显著降低(P<0.01)。MTT检测结果显示,转染后EC109细胞增殖能力受到显著抑制(P<0.01),FCM检测显示细胞周期阻滞在G_1/G_0期(88.56±4.96,P<0.01),早期凋亡和晚期凋亡细胞数量均显著增加(P<0.01)。Western blot实验结果显示,CDK2-Cyclin A/E蛋白表达量显著下调。结论 CACUL1通过调控CDK2-Cyclin A/E信号通路促进食管癌EC109细胞增殖。

双片段连接法克隆融合基因及其突变体

为降低体外扩增DNA而引入随机突变的风险,仅通过PCR在CDK2序列5′端接入连接序列。由于双Bam HⅠ位点的干扰,cyclin E与CDK2序列无法依次插入载体,故采用双片段连接法将两者一起连接插入质粒载体以构建融合基因;采用相似策略,用CDK2突变体序列替换融合基因中对应野生型序列以构建融合基因突变体。两组双片段连接物转化感受态大肠杆菌后均能筛选出若干菌落,并成功鉴定出目标克隆。双片段连接法突破了严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,拓宽了酶切-连接法拼接DNA片段的适用范围。据此可充分利用现有条件,通过灵活置换DNA片段简化融合基因及其突变体克隆流程。