猪瘟病毒流行株与疫苗株E^(rns)基因的序列分析

采用RT-PCR技术扩增了HCV 10个野毒株、4批不同厂家生产的兔化弱毒疫苗株和1个标准SM株Erns基因的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的15个HCV毒株与国内外6个参考毒株Alfort、Ald、Brescia、Gpe、C、CW株的相应片段进行了同源性比较分析。15株HCV Erns基因长度均为696 bp,其核苷酸及氨基酸的同源性分别为83.0%~100.0%和87.9%~100.0%。系统发生分析可将这些毒株分为Ⅰ和Ⅱ两大基因群及4个亚群,Erns基因与E2、NS5B基因在系统发生分析中具有较高的一致性。国内4批不同厂家生产的兔化弱毒疫苗相对稳定,仅1~2个氨基酸残基具有差异。通过对10个流行株与SM株Erns基因的比较分析,发现我国HCV具有复杂性、多样性和相对的遗传稳定性;所测15株HCV Erns基因具有RNase活性的2个区域SLHGIWPG(或E)(28~36位)和EWNKHGWC(75~82位)十分保守,但疫苗毒SLHGIWPE基序中的E替换为G,而基序中位于30和79位的H(组氨酸)为RNase的催化活性关键氨基酸残基,高度保守,15个HCV Erns基因和6株参考株没有一株发生变异。本研究为开展Erns基因的生物学活性、结构与功能等方面的研究奠定了基础。

猪瘟E^(rns)基因在大肠杆菌中的高效表达

提取猪瘟病毒石门系强毒株的基因组RNA,用RT_PCR扩增其Erns基因的cDNA,将其克隆到原核表达载体pPROEXTMHTc中,然后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,Erns基因获得高效表达。SDS_PAGE分析显示,表达的重组融合蛋白表现分子量约为31ku。Westernblot分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性。重组蛋白可用于制备诊断抗原,用于标记疫苗接种和野毒感染的鉴别诊断。

猪瘟兔化弱毒株E^(rns)基因的克隆及序列分析

从兔脾组织中提取猪瘟病毒兔化弱毒株RNA,利用RT-PCR技术,扩增了猪瘟兔化弱毒的第一个囊膜糖蛋白基因Erns,并对其进行了序列分析。核苷酸序列比较发现,CSFV与Brescia株和GPE-株的同源性为94.6 %,与石门毒株和Alfort/A19株的同源性为95.0 %,与ALD株的同源性为95.4 %。根据核苷酸序列推导出氨基酸序列,并进行氨基酸序列同源性比较,结果表明,CSFV与Alfort/A19株和ALD株的同源性为93.8 %,与GPE-株的同源性为93.0 %,与石门毒株和Brescia株的同源性分别为94.7 %和95.2 %。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns基因的生物学功能,将含有牛病毒性腹泻病毒 Erns基因的质粒pMD18-T-Erns经BamH I／HindⅢ双酶切,获得了Erns片段,再与杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A连接,构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns与Bac-N-BlueTM DNA 共转染至sf9昆虫细胞中,获得了重组病毒,经噬斑筛选纯化,感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS- PAGE分析结果表明,表达的目的蛋白大小约30 ku;Western-blotting检测表明,该蛋白具有良好的抗原性。