乙型肝炎病毒e抗原基因与绿色荧光蛋白基因的融合及其表达

质粒pS65T含有T7启动子驱动的绿色荧光蛋白突变型gfpS65T基因，经修饰后，在其中插入乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）基因，使两基因同框成为融合基因。在大肠杆菌BL21中由于T7启动子的控制，高效表达了具有双功能（抗原性和发光性）的融合蛋白（GFP－HBeAg）。融合蛋白MW为52kDa，N端有6个组氨酸残基，因而用Ni金属螯合层析柱对融合蛋白进行了分离纯化，利用诊断HBV的ELISA试剂盒检测了融合蛋白的抗原性，在荧光显微镜下观察到了融合蛋白的绿色荧光。并探讨了用其组装成新型免疫诊断试剂的可能性。

登革2型病毒E抗原基因的RT-PCR扩增及表达载体的构建

目的扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ法、基因克隆和限制性内切酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区内设计一对ＰＣＲ引物。通过ＲＴ－ＰＣＲ，获得１６００ｂｐＥ抗原编码基因全长ＤＮＡ片段，将其克隆至ｐＫＫ２２３－３质粒的ｔａｃ启动子下游构建成Ｅ抗原表达载体。结论为型特异性Ｅ抗原基因的进一步亚克隆和表达奠定基础；为其他型别登革病毒Ｅ抗原基因的同类研究提供借鉴。

绿色荧光蛋白基因与乙肝病毒e抗原基因在家蚕细胞中的表达

用绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｅ抗原基因融合，构建了家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）重组转移载体ｐＢｍＧＨｅ，使融合基因处于多角体基因（ｐｌｈ）启动子控制之下。共转染后得到的重组病毒ｒＢｍＧＨｅ能在家蚕细胞中表达约５０ｋＤａ的ＧＦＰ／ＨＢＶｅ融合蛋白。被感染的细胞在紫外光下发射出美丽的绿色荧光。用ＥＬＩＳＡ检测，ＨＢｅＡｇ抗原活性滴度达到１１２８００。这种既能发射绿色荧光又具有抗原活性的双功能融合蛋白为研制一种新型的发光免疫诊断试剂开辟了一条新路。

猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM Teasy载体上,测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域,切出目的基因,将目的基因克隆到表达质粒pProEX HTb中,获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确,SDS PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白,Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。

黑色素瘤相关性抗原E1基因的克隆与测序

目的 克隆表达人黑色素瘤相关性抗原MAGE E1片段 ,以便研究其对神经系统恶性肿瘤的生物学作用。方法 从人胶质瘤细胞系BT 32 5中提取mRNA ,用RT PCR法从中扩增出MAGE E1片段 ,采用DNA重组技术将其克隆于 pGEM TEasy载体中并测序。 结果 RNA体外扩增得到的片段为 4 0 0bp ,PGEM MAGE E1经酶切鉴定正确 ,测序结果与Genebank比较完全相同。

淋巴细胞抗原6复合物基因座E抑制新型冠状病毒不同变异株刺突蛋白介导的感染侵入

目的研究淋巴细胞抗原6复合物,基因座E(lymphocyte antigen 6 complex,locus E,LY6E)对新型冠状病毒(severe acute respiratpry syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)不同变异株刺突蛋白(spike protein,S蛋白)介导的感染侵入的抑制作用。方法构建来源于人的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)表达质粒;建立Flp-In T-Rex 293/LY6E诱导表达细胞系和Flp-In T-Rex 293/氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)诱导表达细胞系,转染人ACE2表达质粒,并通过免疫印迹方法检测ACE2和LY6E在T-Rex 293细胞中的表达情况;构建SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1株系、D614G突变株系、Delta突变株系,以及Omicron BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5、BF.7突变株系)和拉沙热病毒(Lassa fever virus,LASV)假病毒感染系统,利用假病毒荧光素酶报告基因检测LY6E对SARS-CoV-2及其突变株刺突蛋白介导侵入的抑制作用;通过Nano-Glo活细胞检测系统,检测LY6E对SARS-CoV-2突变株刺突蛋白介导的合胞体形成的抑制作用;构建甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)假病毒感染系统,经两性霉素B处理后,利用假病毒荧光素酶报告基因检测LY6E对SARS-CoV-2及其突变株刺突蛋白介导侵入的抑制作用。结果构建的Flp-In T-Rex293/LY6E诱导表达细胞系对SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1株系、D614G突变株系、Delta突变株系,以及Omicron BA.1突变株系)假病毒侵入细胞有明显抑制作用,SARS-CoV-2假病毒感染四环素(tetracycline,Tet)处理组与非处理组的相对感染率差异有统计学意义[SARS-CoV-2野生型株系假病毒(WTpp):t=33.920,P<0.001;SARS-CoV-2突变株系假病毒(D614Gpp):t=31.478,P<0.001;Deltapp:t=30.257,P<0.001;Omicronpp:t=21.041,P<0.001];LY6E对SARS-CoV-2不同突变株S蛋白介导的合胞体形成有明显抑制作用,LY6E表达组与未表达组的相对荧光单位差异有统计学意义(D614G:t=18.90,P<0.001;Delta:t=22.28,P<0.001;BA.1:t=8.995,P<0.001;BA.2:t=13.57,P<0.001;BA.2.12.1:t=15.48,P<0.001;BA.3:t=13.65,P<0.001;BA.4/5:t=16.74,P<0.001;BF.7:t=22.29,P<0.001);两性霉素B处理没有改变Flp-In T-Rex 293/LY6E诱导表达细胞系对SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1株系、D614G突变株系、Delta突变株系,以及Omicron BA.1突变株系)假病毒侵入细胞的抑制作用,也没有改变LY6E对IAV感染的增强作用,IAV假病毒感染Tet处理组与非处理组的相对感染率差异有统计学意义(t=3.343,P<0.05)。结论LY6E抑制SARS-CoV-2野生型(Wuhan-Hu-1株系)及多种突变株(D614G突变株系、Delta突变株系,以及Omicron突变株系)刺突蛋白介导的感染侵入;两性霉素B没有改变LY6E对SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1株系、D614G突变株系、Delta突变株系,以及Omicron突变株系)的抑制作用。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14 14 2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZαA,以电穿孔法转化酵母X 33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS PAGE和免疫印迹分析表达产物。由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性。在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据。

抗HBeAg不同位点的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及其应用

目的建立检测人乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的双单抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂。方法用基因工程HBeAg免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌针对抗原不同位点单抗的杂交瘤细胞株。将构象型位点单抗和线性位点单抗配对做夹心ELISA,选择最匹配的一对建立双单抗夹心HBeAg检测试剂,并与人抗HBeAg多抗包板、单抗标酶的HBeAg检测试剂盒做对比试验。结果建立了89株能稳定分泌小鼠抗HBeAg的杂交瘤细胞株,其中63株单抗针对构象型位点,26株单抗针对线性位点。挑选出最匹配的7E6和e1构建成检测HBeAg的双单抗夹心ELISA检测试剂。与人抗HBeAg多抗包被、单抗酶标检测试剂对比,双单抗试剂具有更高的灵敏度,而其他指标基本一致。结论我们用不同位点的HBe单克隆抗体建立了高灵敏度、高特异性的有实用价值的HBeAg双单抗夹心ELISA检测试剂。