人纤维蛋白降解产物D-双聚体和E片段的纯化和鉴定

D-双聚体和E片段均为交联型纤维蛋白的降解产物。根据它们的等电点的不同,建立了等电聚焦法纯化D-双聚体和E片段的方法。纯化的D-双聚体分子量约3.32×10^(-22)kg,含γ-γ双聚体片段(分子量1.36×10^(-22)kg)、β链片段(分子量7.30×10^(-23)kg)和α链片段(分子量2.49×10^(-23)kg)。Western Blot结果表明它可被抗D-双聚体单克隆抗体(McAb)识别。纯化的D-双聚体用ELISA检测,证实不含有E片段。纯化的E片段分子量约7.47×10^(-23)kg,还原后形成α链片段(分子量约1.03×10^(-23)kg)、β链片段(分子量6.14×10^(-24)kg)和γ链片段(分子量1.49×10^(-23)kg)3条肽链,可与抗E片段McAb进行免疫学反应。

乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14 14 2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZαA,以电穿孔法转化酵母X 33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS PAGE和免疫印迹分析表达产物。由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性。在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据。

乙脑E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区融合酵母表达载体的构建

构建乙型脑炎E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosis hear shock protein70,Mt．hsp70)的肽连接区(Binding domain)基因融合表达载体,利用酵母表达系 统,为下一步研究肽连接区是否能增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性作准备。以酵 母表达载体pPICZα-A为基本单位构建,以酶切位点BamHI连接这2个基因,用电穿孔法转化酵 母X-33,Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。E蛋 白主要抗原片段与hsp70肽连接区的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为 68kDa,与实际大小相符且为分泌表达,表达量约为97mg／L,经Western印迹验证,抗原性较好。将 用同样的酵母表达载体表达的乙脑E蛋白主要抗原片段(另文发表)与上述融合蛋白均以50pmol． 的量分别对6-8周龄的:BALB／c小鼠进行腹膜内注射,3周后进行第二次免疫,从淋巴细胞的增 殖和抗体滴度两个方面进行比较,最后得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比乙脑E蛋白主要抗 原片段效果要好,在试验中肽连接区可以增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性。

载脂蛋白E基因多态性及脂类代谢与缺血性脑卒中亚型关系的研究

目的探讨载脂蛋白E(apoE)基因多态性及脂类代谢与缺血性脑卒中亚型的关系。方法对急性动脉粥样硬化性脑梗死患者(ACI组)47例、腔隙性脑梗死患者(LI组)急性发作期48例、急性栓塞性脑梗死组患者14例和对照组50例,用聚合酶链反应限制性片段长度多态性进行apoE基因HhaI多态性测定,并进行血脂及载脂蛋白的测定。结果ACI组apoEε4等位基因频率明显高于其他脑卒中亚型及对照组(P<0.05)。ACI组的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显低于其他3组,而低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显高于其他3组(P<0.05)。ACI组各等位基因间血脂水平比较,含ε4等位基因者LDL-C水平高于含ε3者(P<0.05)。无论是E3/3还是E3/4 ACI组的总胆固醇水平均高于对照组,HDL-C水平均低于对照组(P<0.05)。在E3/4 ACI组的LDL-C水平明显高于对照组。结论apoEε4等位基因与ACI发病及血脂代谢改变有关;LI的apoE基因多态性研究与ACI不一致,说明apoE基因多态性在LI的发病中无明显的致病作用;不同类型的脑卒中亚型急性发作期血脂水平不同。

乙脑E蛋白与结核杆菌HSP70的融合蛋白对BALB/c小鼠特异性免疫的影响

研究酵母表达的乙脑病毒(JapaneseEncephalitisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )形成的融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹膜内注射蛋白的方法免疫小鼠,以直接免疫E蛋白主要抗原片段和以E蛋白主要抗原片段和单独表达的hsp70两者均以5 0pmol的量进行混合后的蛋白免疫的小鼠作为对照,用半定量RT PCR检测细胞免疫因子IL 2mRNA的水平,IL 2是细胞介导的免疫反应和巨噬细胞激活中的关键分子,MTT法检测淋巴细胞的增殖情况以及通过ELISA检测抗体水平,从这3个方面来评价融合与未融合蛋白以及等量混合后的免疫效果。结果E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70重组后,mIL 2 ,淋巴细胞的增殖以及抗体水平均较重组前明显升高,因此,以乙脑E

表皮生长因子受体Ⅲ型变异体(EGFRvⅢ)多克隆抗体的制备及特异性

为了制备针对EGFRvⅢ的特异性多克隆抗体,在实验中利用耦联了血蓝蛋白的EGFRvⅢ特异性的PEP3合成短肽进行动物免疫,制备抗血清;构建了pET30a/E33XI原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白His-E33(EGFRvⅢ的部分胞外区);以此融合蛋白作为抗原制备了抗体纯化柱,通过柱上纯化的方法从抗血清中提取针对EGFRvⅢ的特异性抗体.利用U87、U251、HeLa和HEK-293细胞进行免疫组化实验来检验抗体的特异性.

番茄E8基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达

利用PCR技术从番茄基因组DNA中克隆长约1.1kb的E8基因启动子与517bp的E8基因片段,将其二者连接构建植物表达载体,导入农杆菌,通过花序侵染法转化拟南芥,得到转基因拟南芥。用RT-PCR分析转基因拟南芥中E8基因启动子驱动E8基因小片段的结果表明,E8基因小片段mRNA仅在转基因拟南芥长角果中转录,根、茎、叶、花中不转录,提示E8基因的1.1kb启动子在异源植物拟南芥中仍具有驱动外源基因果实特异性表达的特性。

大鼠骨骼肌挫伤后TGF-β1及EⅢA-FN的表达与损伤时间推断

目的研究大鼠骨骼肌生前损伤、生前损伤死后以及死后损伤不同时间点转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)及纤连蛋白EⅢA片段(EⅢA-fibronectin,EⅢA-FN)的表达情况,探讨其在损伤时间推断上的应用价值。方法建立大鼠骨骼肌挫伤模型,随机分为正常对照组(5只)、生前挫伤组(40只)、生前挫伤死后表达组(110只)和死后挫伤组(25只)。应用免疫组织化学染色检测生前挫伤组大鼠骨骼肌中TGF-β1及EⅢA-FN的蛋白表达情况,同时应用实时荧光定量PCR技术检测各组TGF-β1及EⅢA-FN mRNA的表达变化。结果免疫组织化学染色结果显示:生前挫伤后12h～14d,损伤区内大量多形核白细胞、单个核细胞和成纤维样细胞强表达TGF-β1;伤后3～7d,EⅢA-FN主要分布于细胞外基质。实时荧光定量PCR检测结果显示:生前挫伤组TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表达分别于伤后3d和5d达到峰值;生前挫伤死后表达组大鼠TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表达分别于死后6h和12h达到峰值;死后挫伤组中死后0.5～12h致伤的大鼠TGF-β1和EⅢA-FN mRNA表达明显低于正常对照组及生前挫伤组。结论 TGF-β1及EⅢA-FN有望成为骨骼肌损伤时间推断的参考指标。

GM-CSF增强HPV16DNA疫苗免疫效果的研究

目的 :探讨GM CSF增强HPV16E6cDNA疫苗免疫效应的作用。方法 :①将C5 7BL 6小鼠 18只分为 1、2、33个组。DNA免疫前 ,每只小鼠胫骨前肌注射 0 .2 5 %的布比卡因 10 0 μl,2 4h后 ,1组注射pcDNA3.1为对照组 ;2组注射pcDNA3.1E6c ;3组注射pcDNA3.1E6c +GM CSF ,2周后加强免疫 1次 ;②加强免疫 2周后 ,取小鼠脾脏及血清进行免疫功能测定。结果 :①T细胞增殖实验结果 :3 H TdR掺入率 :1组为6 736 ,2组为 15 732 ,3组为 2 6 95 9,2组比 1组提高了 133.5 % ,3组比 1组提高了 2 78.7%、比 2组提高了71.4 % ,经t检验表明 ,3组间的两两比较差异均有统计学意义 ,P <0 .0 1;②E6CTL表位合成肽特异性刺激后IFN γ的产量 :1组无IFN γ产生 ,2组为 6 2 4 .8,3组为 832 .9,3组比 2组提高了 33.3% ,经t检验表明 ,两组间差异有统计学意义 ,P <0 .0 1;③特异性抗体的产生 :1组为 0 .0 4 2 33,2组为 0 .4 5 75 ,3组为 0 .812 5 ,2组是1组的 9.8倍 ,3组是 1组的 18.2倍 ,3组比 2组提高了 77.6 %。经t检验表明 ,3组间的两两比较差异均有统计学意义 ,P <0 .0 1。结论 :GM CSF可有效的提高HPV16E6cDNA疫苗的细胞和体液免疫效应。

广东省登革Ⅰ型病毒E/NS1基因片段核苷酸序列分析

目的 分析广东省 1979～ 1999年不同地区登革Ⅰ型病毒地方分离株和国外毒株之间的遗传关系 ,并探讨其可能来源。方法 提取病毒RNA ,用一步法逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增E/NS1连接区基因片断 ,克隆于pBluescriptⅡSK质粒上进行序列测定 ,并将测序结果与Genbank中其他登革Ⅰ型病毒E/NS1基因片段的 2 4 0bp核苷酸进行比较 ,用计算机软件分析结果。结果 广东省分离到的 14株登革Ⅰ型毒株中 ,基本可分为两个基因亚型 ,它们与印度尼西亚毒株的核苷酸最大同源性为 99 2 % ,与菲律宾毒株的核苷酸最大同源性为 10 0 % ,与泰国毒株的核苷酸最大同源性为 98 8%。结论 广东省的登革Ⅰ型病毒可能来源于菲律宾、印度尼西亚和泰国等东南亚和西太平洋国家。

宫颈癌组织Survivin、HPV16E7水平与患者临床病理特征、预后及化疗敏感性的关系研究

目的:探究宫颈癌(CC)组织生存蛋白(Survivin)、人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16E7)水平与患者临床病理特征、预后及化疗敏感性的关系。方法:选取2020年7月—2022年4月联勤保障部队第九八九医院平顶山医疗区收治的118例CC化疗患者作为研究对象,检测组织Survivin、HPV16E7表达情况,并分析其与临床病理特征、总生存期(OS)、化疗敏感性的关系。结果:组织Survivin阳性表达与FIGO分期、组织分化、淋巴结转移具有密切的相关性,组织HPV16E7阳性表达与FIGO分期相关,差异均有统计学意义(χ^(2)=23.741、18.819、15.311、7.715,P<0.05)。不同分期下,OS<6个月患者组织HPV16E7阳性表达率均高于OS≥6个月患者,差异均有统计学意义(χ^(2)=6.667、6.089,P<0.05)。化疗敏感患者组织Survivin、HPV16E7阳性表达率均低于化疗抵抗患者,差异均有统计学意义(χ^(2)=23.248、7.859,P<0.05)。Survivin与HPV16E7mRNA表达水平呈正相关(r=0.326,P<0.05)。结论:CC组织Survivin、HPV16E7水平与患者临床病理特征、预后及化疗敏感性具有密切的相关性。

携带猪乙型脑炎DNA疫苗减毒沙门菌的构建及其免疫原性

将乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因串联,构建真核表达载体pCI-EAB。将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出目的基因的转录与表达。质粒pCI-EAB电转化入减毒猪霍乱沙门菌,观察重组菌的安全性、体内外的稳定性与免疫原性。动物试验表明,重组菌是相对安全和稳定的;重组菌S.C500/pCI-EAB体外培养时,D600值在0.8左右质粒是比较稳定的;以1×108CFU剂量的重组菌S.C500/pCI-EAB口服免疫小鼠,在二免后1周和三免后1周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显著(P<0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P<0.01)。上述结果初步表明,以减毒沙门菌为载体的猪乙型脑炎DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为猪乙型脑炎口服活菌疫苗的研制奠定了基础。