E-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿嘧啶的简便合成方法研究

以2'-脱氧尿嘧啶为原料,在糖苷羟基未保护情况下,经过羟甲基化、选择性氧化、Knoevenagel缩合和Hunsdiecker反应等4步反应,简便地合成了抗病毒药物E-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿嘧啶,为工业化生产提供了可靠的依据.

5-杂氮-2’-脱氧胞苷和5-氟尿嘧啶对食管癌细胞系中E-Cadherin和TIMP3基因甲基化状态及蛋白表达的影响

目的:观察去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和5-氟尿嘧啶(5-FU)对食管癌细胞系EC1和EC9706(均存在E-Cadherin甲基化改变和TIMP3基因未发生甲基化改变)中2种基因甲基化状态及蛋白表达的影响。方法:用5-Aza-CdR和5-FU分别作用于EC1和EC9706细胞,应用甲基化特异性PCR检测2种药物处理前后细胞中E-Cadherin基因和TIMP3基因的甲基化状态,应用免疫细胞化学方法检测TIMP3和E-Cadherin蛋白的表达。结果:5-Aza-CdR或5-FU处理后两种食管癌细胞系中TIMP3基因仍为非甲基化;5-Aza-CdR作用后,两种食管癌细胞系中E-Cadherin基因的甲基化状态发生了逆转,而5-FU作用后,E-Cadherin基因的甲基化状态无改变。EC1和EC9706经5-Aza-CdR处理后TIMP3蛋白表达无改变,而经5-FU处理后表达增强(P<0.05),EC1和EC9706经两种药物处理后E-Cadherin蛋白表达均增强(F=116.835、119.628、191.700和210.532,P<0.001)。结论:5-Aza-CdR能够有效逆转EC1和EC9706细胞中E-Cadherin基因甲基化状态,并使其蛋白恢复表达;对TIMP3基因的甲基化状态和蛋白表达影响不大。

HPLC法同时测定人血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的浓度

目的:建立一种同时测定人体血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷浓度的HPLC法。方法:以肌苷为内标,血浆样品用硝酸银(10%)沉淀蛋白质,采用C_(18)柱,检测波长为266nm,流动相:0.01mol·L^(-1)磷酸盐(用2mol·L^(-1)氢氧化钠溶液调pH为7.0)-甲醇(96∶4),流速1.0mL·min^(-1),柱温为45℃。结果:5-氟尿嘧啶和5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷分别在0.1～20μg·mL^(-1)(r=0.9997)和0.2～40μg·mL^(-1)(r=0.9997)浓度范围内线性关系良好,最低检测浓度分别为5和10ng·mL^(-1),方法回收率分别为98.2%～101.2%、99.5%～102.3%,日内、日间RSD均小于6%。结论:方法灵敏、快速、准确,适用于临床上测定5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的血药浓度及药动学的研究。

5-氟尿嘧啶-2’-脱氧核苷经胃左动脉介入灌注后的药代动力学实验研究

目的研究术前经胃左动脉行介入灌注后5鄄氟尿嘧啶鄄2’鄄脱氧核苷(FUDR)的药代动力学变化。方法将20头健康幼猪随机分成2组,分别于术前经胃左动脉行介入化疗(IAC)或全身性静脉化疗(SC)。标本中FUDR的浓度用高效液相色谱(HPLC)法测定。结果IAC组胃壁和胰腺中FUDR的曲线下面积(AUC0鄄49)明显高于SC组;注药后60min时部分胃周淋巴结中的FUDR平均浓度明显高于SC组;在心脏和肾脏中明显低于SC组。结论术前经胃左动脉行介入化疗后,FUDR的药代动力学变化明显优于全身性静脉化疗。本实验为在临床上术前采用经胃左动脉介入化疗治疗胃癌提供了实验性依据。

5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性

背景:深入准确地研究骨髓间充质干细胞在体内外增殖、分化的规律,寻找安全、有效、灵敏度高、特异性强、简便的标记活细胞的方法至关重要。目的:探索5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的有效性及对其增殖能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞至第3代。将细胞以5×107L-1浓度接种于96孔板中,掺入法加入终浓度为0,10,20,50μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷,分别在培养24,48和72h检测5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记细胞的阳性率、标记后的细胞形态,并绘制标记细胞的生长曲线。结果与结论:各浓度组标记率均随标记时间延长而升高(P<0.05);各时间点标记率随标记浓度的升高而增加,但其差别无显著性意义(P>0.05)。10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。标记前后各组间充质干细胞生长曲线均呈"S"形。说明在实验浓度范围内应用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞有效,不影响细胞的增殖,且10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷与5-氟尿嘧啶的协同抗胃癌作用

目的:观察甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-Deoxycytidine,5-Aza-CdR)对胃癌细胞的作用,并进一步明确他与传统化疗药5-氟尿嘧啶(5-Fu)之间的相互关系.方法:选取野生型P53的胃癌AGS和突变型P53的BGC-823细胞用2.5mol/L5-Aza-CdR分别处理0-96h,MTT检测5-Aza-CdR处理前后细胞活力的变化.为了进一步探讨5-Aza-CdR的抗胃癌作用机制,我们用AnnexinⅤ检测细胞早期凋亡、caspases活性检测凋亡诱导通路及Westernblot检测下游相关蛋白的表达.结果:与未用5-Aza-CdR处理的空白对照组细胞相比,5-Aza-CdR时间依赖性地抑制了胃癌AGS和BGC-823细胞的生长活性(P<0.01).在探讨其作用机制时我们发现,5-Aza-CdR的抗胃癌毒性作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的.但细胞的不同P53状态可触发不同的细胞凋亡路径:在野生型AGS细胞中,5-Aza-CdR的凋亡机制是通过内源性的凋亡通路(caspase9)所介导的;但在BGC-823细胞中,5-Aza-CdR的促凋亡效应是独立于caspase凋亡路径的,因为我们并未观察到5-Aza-CdR处理后细胞caspases活性及蛋白表达水平的增加.尤为有意义的是,当5-Aza-CdR与5-Fu联合应用后,他显著增加了AGS和BGC-823细胞对5-Fu的敏感性.结论:以上数据明显证明5-Aza-CdR可作为一种卓有成效的抗胃癌药,特别是他与传统化疗药的协同抗癌效应,将对5-Aza-CdR未来在临床上的应用提供实践指导意义.

5-(2-溴乙烯基)-4-硫代尿苷合成工艺的改进

4-硫尿苷类似物可作为一种抗肿瘤药物使用,在硫代尿苷5-位引入溴乙烯基可以改变核苷的电子云分布,并与嘧啶环形成共轭,使其最大吸收波长发生红移。设计了新的5-(2-溴乙烯基)-4-硫代尿苷合成路线,在碘代中用硝酸铈铵代替稀硝酸,同时在硫代过程中用劳森试剂代替五硫化二磷,具有反应条件温和、反应时间缩短、产率提高、易于分离的优点并且对产物进行表征。

2'-脱氧-5-氟尿苷的合成工艺改进

目的:改进2'-脱氧-5-氟尿苷的合成工艺。方法:参照文献方法,以氟尿嘧啶为起始原料,经硅醚化、缩合、溴化、氢化和皂化等工艺合成2'-脱氧-5-氟尿苷,并对其关键步骤进行了改进。结果:该合成工艺对2'-脱氧-5-氟尿苷有较高的收率,总收率为34.31%。结论:工艺更趋于合理,操作条件更为简单,三废易于处理,适合于工业化生产。

2-溴-3,3,3-三氟丙烯的合成与应用

介绍了2溴3,3,3三氟丙烯的用途及合成方法。

5-Aza-CdR对肾细胞癌Caki-1细胞生长及E-钙黏蛋白基因表达的影响

目的:研究甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肾细胞癌细胞株Caki-1增殖抑制作用、对E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)甲基化状态及E-cad蛋白状态的影响。方法:不同浓度5-Aza-CdR处理肾细胞癌细胞株Caki-1后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验观察细胞经药物处理前后的生长活性;甲基化特异性PCR(methylationspecial PCR,MSP)检测细胞处理前后E-cad基因的甲基化状态;蛋白质印迹法检测5-Aza-CdR处理细胞前后E-cad蛋白的表达。结果:5-Aza-CdR能抑制肾细胞癌细胞株Caki-1的增殖;未经药物处理组的基因高甲基化,经10-6mol/L5-Aza-CdR处理72 h,E-cad基因启动子区域高甲基化得到逆转,同时E-cad蛋白表达也得到增强。结论:5-Aza-CdR能够有效逆转Caki-1细胞E-cad基因的异常甲基化,恢复E-cad蛋白表达。

5-Aza-CdR联合5-FU对人结肠癌SW480和LS-174T细胞生长、凋亡的影响

目的观察5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)联合氟尿嘧啶(5-FU)对人结肠癌SW480和LS-174T细胞生长、凋亡的影响。方法将SW480和LS-174T细胞各分为四组:对照组、DAC组、5-FU组、联合组,对照组以等量PBS液加入SW480或LS-174T细胞培养液中;5-FU组用100μg/m L的5-FU干预SW480或70μg/m L的5-FU干预LS-174T细胞24 h;DAC组用5μmol/L的DAC干预SW480或LS-174T细胞48 h;联合组予5μmol/L的DAC干预SW480或LS-174T细胞48 h,再用100μg/m L的5-FU干预SW480或70μg/m L的5-FU干预LS-174T细胞24 h。MTT法测算细胞增殖抑制率;实时荧光定量PCR法检测各组凋亡相关基因(Bax、Bcl-2)mRNA表达;免疫细胞化学法检测Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 DAC组和5-FU组细胞增殖抑制率高于对照组(P均<0.05),而联合组与其他三组相比细胞增殖抑制率亦升高(P均<0.01)。DAC组、5-FU组与对照组相比,Bax mRNA及蛋白表达增多(P均<0.05);与其他三组相比,联合组中Bax mRNA及蛋白表达增多(P均<0.01)。5-FU组、联合组与对照组相比,Bcl-2 mRNA及蛋白表达减少(P均<0.05),而联合组与5-FU组相比,Bcl-2 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 5-Aza-CdR和5-FU均能抑制人结肠癌SW480、LS-174T细胞生长,促进细胞凋亡,联合时作用更显著。

(E)-4-硫-5-(2-溴乙烯基)尿苷/脱氧尿苷的合成及细胞毒性评价

以尿苷(1a)或2'-脱氧尿苷(1b)类化合物为原料,经碘代、选择性氧化、Heck反应等步骤快捷、环保地合成(E)-5-(2-溴乙烯基)尿苷/(E)-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿苷(5a/5b),再通过酯化、硫羰基化、氨解等步骤合成新化合物(E)-4-硫-5-(2-溴乙烯基)尿苷/(E)-4-硫-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿苷(8a/8b),共得到5种新的硫代产物,其中包含2种新产物8a/8b,3种新中间体7a,7b,10.其结构通过~1H NMR,^(13)C NMR,IR,UV,HRMS,X-Ray等谱图手段进行了表征.采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)实验方法对8a及其类似物进行了细胞毒性评价,发现8a/8b是潜在的抗肿瘤药物.

Snail与E-钙粘素甲基化协同抑制E-钙粘素的表达

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(简称5-Aza)对转录调节因子Snail的作用,转染反义Snail与5-Aza对上皮间质转化相关膜蛋白E-钙粘素的mRNA水平的影响及二者联合作用的可能机制。方法应用MTT、PCR、实时荧光定量PCR、检测低分化胃腺癌细胞株分别转染反义Snail、应用5-Aza单独或协同干预后对细胞的生长增殖及Snail、E-钙粘素mRNA表达的影响。结果与空白对照组比较5-Aza干预、转染反义Snail分别及二者共同干预均增加E-cadherin的mRNA的表达,空质粒组无显著差异。5-Aza上调Snail基因mRNA的表达。两种干预方式处理均能抑制胃癌细胞的生长。结论 5-Aza、转染反义Snail均使E-cadherin mRNA表达增强,且药物作用呈时间浓度依赖性。5-Aza能上调Snail基因的表达,提示甲基化作用在同时下调转录调节子Snail基因表达和抑制E-钙粘素表达。

酶法合成2＇－脱氧－5－氟尿苷

本文采用大肠杆菌核苷磷酸化酶，以５－氟尿嘧啶（ＦＵ）、２＇－脱氧尿苷（ｄＵ）和磷酸盐为底物酶法合成２＇－脱氧－５－氟尿苷，实验结果表明，含１０ｍｍｏｌ／ＬｄＵ、３０ｍｍｏｌ／ＬＦＵ、１０－３０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐的混合物加入５％培养２４ｈ的大肠杆菌湿菌体于ｐＨ７．０反应３ｈ，底物ｄＵ的转化率可达４５．９％。

促红细胞生成素对新生鼠缺氧缺血性脑损伤后5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷表达的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后海马颗粒下带(SGZ)5-溴-2-脱氧尿嘧啶(Brd U)表达的影响。方法选择7日龄新生Wistar大鼠制备新生鼠HIBD动物模型,按照体重将新生鼠随机分为假手术组、HIBD模型组、EPO实验组(EPO 5 U·g-1·d-1×14 d)。在术后第14天、第21天、第28天,动态检测海马SGZ区Brd U阳性细胞数。结果海马SGZ区Brd U阳性细胞表达:3组新生大鼠在术后第14至28天,Brd U阳性细胞数随着新生鼠日龄增加而明显减少(P<0.01);在术后第14天、第21天、第28天,3组新生大鼠的海马SGZ区Brd U阳性细胞数以EPO实验组最多,其次为HIBD模型组,假手术组最少。在术后第21天,假手术组、HIBD模型组、EPO实验组的海马SGZ区Brd U阳性细胞数分别为8.08±1.62,25.71±4.18,32.21±8.63。在术后第14天、第21天,3组间两两比较差异有统计学意义(P<0.01);术后第28天,实验组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论新生鼠HIBD早期给予EPO干预治疗对新生鼠缺氧缺血性脑损伤可能有神经保护作用。

胚胎期X线照射致大鼠皮质-纹状体区异常的研究

为探讨胚胎期X线照射致大鼠皮质-纹状体区的异常,本研究选取妊娠14d(E14)大鼠接受X线(剂量为1.0Gy)照射。照射前2h经尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU),用以标识E14的神经细胞的发生。取不同时期(E14-E18)胚脑用于HE染色、BrdU免疫组化染色及Fluoro Jade B(FJB)染色观察。结果显示:HE染色观察到E14大鼠受X线照射后背侧端脑有大量细胞脱落入侧脑室并在2d后被完全清除,而腹侧的皮质-纹状体区在照射后2d形成空洞并于4d后修复。BrdU标识显示腹侧端脑的外侧节隆起的神经细胞移动类似于正常对照组,2d后阳性细胞分布在皮质-纹状体区形成的空洞周围,4d后移动到腹侧皮质板。Fluoro Jade B染色显示照射后1d在皮质-纹状体区有大量阳性细胞,2d后显著减少。本实验结果提示:E14大鼠受X线照射引起外侧节隆起的神经细胞在移动过程中死亡并导致皮质-纹状体区形成空洞,从而引起内囊发生异常。

S-亚硝基谷胱苷肽对内皮素诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察脂溶性一氧化氮(NO)前体药物S亚硝基谷胱苷肽(GSNO)对内皮素(ET)诱导的SD大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法体外培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,并用ET诱导增殖,用不同浓度的GSNO干预,采用四唑盐比色试验法、5溴2脱氧尿嘧啶(BrdU)酶联免疫吸附试验掺入量测定其对增殖的影响,并以流式细胞技术观察细胞增殖周期的改变。结果ET对VSMC的DNA合成和增殖有显著的促进作用;不同浓度的GSNO干预后,吸光度(A值)和BrdU掺入量与单纯ET诱导对比均明显下降(P<0.05);S期及G2/M期细胞百分值明显低于ET组,而G0/G1期的细胞百分值增高(P<0.05),且随着浓度的增加,抑制作用越显著。结论在一定浓度范围内,GSNO呈剂量依赖性地抑制ET诱导大鼠VSMS增殖。

5′-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷标记人巨细胞病毒感染SD大鼠脑组织神经元模型的建立

目的用5′-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记的人巨细胞病毒（HCMV）进行脑内定位注射，建立SD大鼠脑组织感染模型；研究大鼠脑组织海马部位神经元对HCMV的容许性及HCMV在其内的感染特点。方法运用BrdU标记HCMV基因组，并测定病毒滴度。将21只SD大鼠随机分为病毒感染组（n=18）及对照组（n=3），病毒感染组根据感染时间分为感染24、48及96h组。每个感染时间组再分为2μl及4μl两个剂量组，每个剂量组包括3只动物，均以脑内注射途径将BrdU标记的HCMV直接注入大脑海马部位；对照组大鼠注射不含病毒的细胞培养上清液（4μl）。感染大鼠术后分笼饲养，于各感染时间点处理大鼠取脑组织，冰冻切片；对海马周围部位脑组织分别运用抗BrdU及抗微管相关蛋白2（MAP-2）抗体进行免疫荧光双标染色检测标记病毒；抗pp65抗体免疫组化染色及Nissil复染检测病毒蛋白pp65。结果病毒感染后24h，两个剂量组均未在神经元内检测到标记病毒及pp65。病毒感染后48h和96h，两个剂量组在海马部位神经元中均检测到了标记病毒阳性荧光及pp65的阳性着色；而且2μl组的受感染神经元细胞数较4μl组少，但同一剂量组在48h和96h受感染神经元细胞数未见明显变化。结论成功建立了BrdU标记HCMV感染SD大鼠啮组织的模型。大鼠脑组织海马部位神经元是HCMV的半容许细胞，HCMV在其内仅表现为潜伏性感染。

BrdU-ELISA法测定四逆汤及组方药提取物对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察四逆汤 (SNT)及组方药提取物对大鼠主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。方法采用 MTT比色法和 Brd U- EL ISA法观察药物对离体大鼠 VSMC增殖的影响。结果 Brd U- EL ISA法结果表明四逆汤总提取物 (EST)对 VSMC的 Brd U掺入 DNA没有显著影响 ,而 MTT测定表明 EST可以提高 VSMC的脱氢酶活性。甘草 (L E)、附子 (AE)、干姜 (GE)、甘草加附子 (L AE)、干姜加附子 (AGE)提取物显著提高VSMC的脱氢酶活性 ,同时提高 VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平。结论 EST可以增加 VSMC的脱氢酶活性 ,但对 VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平无影响。而其他组方药提取物可以增加 VSMC的脱氢酶活性 ,同时提高VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平。

荧光素标记5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷合成及荧光光谱研究

由5-溴-2′-脱氧尿苷通过1,2,4-三唑和硫代乙酸在温和的条件下合成4-硫-5-溴-2′-脱氧尿苷,再通过单溴二胺(monobromobimanes,mBBR)对5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷4位硫的亲电反应,合成了用单溴二胺(monobromobimanes,mBBR)标记的5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷,并利用1HNMR核磁共振、质谱和紫外光谱对它们的结构进行了表征,并对它的荧光光谱进行分析和研究.此化合物可以产生极高的荧光特性,由此提供了一条对人体中5-4-硫-2′-脱氧尿苷的检测途径.