基于e-PCR的小麦、山羊草属SSR电子指纹图谱的开发

电子指纹图谱的绘制可对电泳结果进行规范化、可视化操作,进而提高小麦分子标记的流通性,加速小麦育种进程。本研究用MicroSAtellite(MISA)软件对小麦属、山羊草属共61个叶绿体和13个线粒体的全基因组SSR标记进行搜索,发现SSR位点的出现频率与基因组类型有关,线粒体、叶绿体基因组均以2次重复的五核苷酸和六核苷酸重复基序为主,同一种类型的基序重复次数与SSR数目成反比;基于电子PCR技术(e-PCR)并结合MapChart软件共筛选出30对引物,其中来源于二倍体和四倍体山羊草属叶绿体全基因组的引物分别有16和2对,来源于四倍体和六倍体小麦属叶绿体全基因组的引物分别有5和2对,来源于六倍体小麦属线粒体全基因组的引物有5对,最后用MapChart软件绘制电子指纹图谱。本研究采用了一种新的SSR引物设计和筛选方法,完成了小麦属、山羊草属叶绿体和线粒体共74个全基因组序列SSR分子标记的初步开发和电子指纹图谱的绘制,为引物开发提供了新思路,有利于提高分子标记的流通性以及小麦种质资源亲缘关系的鉴定。

高粱非编码区SSR引物设计以及e-PCR的验证

本研究通过在NCBI公共数据库的高粱全基因序列中进行简单重复序列SSR搜索,结果显示共有87950个SSR位点,共有1134种重复,其中二元碱基和三元碱基重复所占比例最大,分别占43.36%,32.38%。根据SSR搜索结果设计了高粱SSR引物,通过两次e-PCR验证和筛选引物,随机合成了50对引物。以先锋和乐食两个高丹草品种为材料进行引物的筛选和评价。结果表明,50对引物中有46对引物出带,但只有8对引物具有多态性。这说明在高粱非编码区设计的引物多态性并不高于EST-SSR引物,但对高粱的SSR引物的开发可以起到补充和促进作用。

芸薹属SSR标记e-PCR与云南省芥菜型油菜种质遗传多样性分析

云南芥菜型油菜种质资源丰富,为整理前人搜集的275份芥菜型油菜种质材料亲缘关系与评估电子PCR技术(e-PCR)的实用性,本研究利用搜集的17713对公开发表的芸薹属作物SSR标记在芥菜型油菜参考基因组和cDNA序列中进行e-PCR分析后挑选引物进行群体PCR分析。e-PCR分析结果显示8016对预期有扩增产物,共计扩增37272个位点,平均每对引物扩增4.65个位点;其中336对引物在基因组与cDNA序列均预期扩增2个位点。从336对引物中随机挑选合成20对预期扩增位点覆盖全基因组的SSR标记组合进行群体分析,PCR电泳结果共检测出63个条带,每对引物多态性片段为2~5个,平均每对引物可扩增3.15个条带;标记PIC值变化范围0.03~0.69,平均PIC值0.45,结果符合e-PCR分析预期。群体遗传聚类分析结果表明,云南芥菜型油菜的亲缘关系并不完全与地域性相关,少数来源不同地区的材料也可聚成一类;275份材料可在遗传相似系数为0.70处被划分为八大类群,95份原始记录信息缺失的种质材料大多位于第Ⅷ大类。本研究同时从分子标记层面理清了275份芥菜型油菜种质材料亲缘关系,验证了e-PCR分析结果的有效性,并绘制扩增芥菜型油菜基因内部序列的SSR标记图谱,这将为芥菜型油菜种质资源评价,保护及后续育种利用提供有力的理论依据与技术支持。

基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

超大规模序列比对计算的并行优化

针对生物信息学研究中的超大规模序列比对计算问题进行了研究,解决了现有的e-PCR软件包在处理小麦基因引物扩增比对任务中存在的内存瓶颈、I/O瓶颈和计算时间瓶颈问题,利用数据和任务分割的基本方法,使其最关键的引物与模板的比对计算能够大规模并行,进而采用基于主从通信模式的MPI通信框架进行编程实现,并从任务的缩减、负载平衡、容错和多作业并发等方面进行了优化,最终在百万亿次超级计算机上顺利实现了千核级大规模并行计算,在数十日内即可完成原本预期需要数年的小麦序列扩增比对计算。

多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR检测方法的创新

【目的】创新多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的检测方法,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供参考。【方法】根据GenBank中lsa(E)基因的参考序列设计特异性引物,通过纯化、连接和转化等步骤,提取含有lsa(E)基因片段的重组质粒DNA为标准品进行检测,绘制标准曲线,验证其特异性和重复性,从而对多重耐药基因lsa(E)qRT-PCR检测方法进行创新;使用该检测方法对牛场粪便、土壤、淤泥和卧料等环境样品中lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度进行检测。【结果】该多重耐药基因lsa(E)qRT-PCR检测方法熔解曲线均为平滑单峰,特异性强;扩增效率良好(101.56%);标准曲线呈现良好的线性关系(r^(2)≥0.997);检测拷贝数量范围广(1.71×10^(2)~1.71×10^(8) copies·μL^(-1))且灵敏度高,组内组间变异系数范围为0.45%~1.66%,重复性强;使用该方法检测牛场环境样品,lsa(E)基因拷贝数量范围为2.54×10^(4)~1.52×10^(8) copies·μL^(-1),相对丰度范围为9.39×10^(-4)~1.20×10^(3),而普通PCR方法仅能在拷贝数量大于1×10^(6) copies·μL^(-1)的环境样品中检测到lsa(E)基因。【结论】本研究创新了多重耐药基因lsa(E)的qRT-PCR检测方法,特异性强,灵敏度高,检测范围广,且能应用于不同养殖环境样品(粪便、土壤和淤泥等)中lsa(E)基因的定量检测,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供技术支持和理论指导。

载脂蛋白E基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗塞关系的研究

应用聚合酶链反应(PCR)扩增ApoE基因外显子4中编码112位和158位氨基酸的DNA片段 ,将该长为292bp的PCR产物以HhaI酶切 ,根据其限制性片段长度多态性图谱确定ApoE基因型。对广东汉族人群的50例动脉粥样硬化脑梗塞 (ACI)患者和50例健康对照者的ApoE基因多态性频率的研究结果表明 :所研究的人群中 ,ApoE基因多态性频率与ACI没有关联。ACI患者中各基因型亚组之间血清TG和TC浓度无显著性差异。

二重PCR检测猪、鸡源致病性大肠杆菌、沙门氏菌磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2、Sul3)的研究

利用二重PCR对临床分离的猪、鸡源致病性大肠杆菌103株和沙门氏菌33株的3个磺胺类药主要耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了检测。结果表明,在19株耐SD的沙门氏菌中有17株检测出Sul1或Sul2基因,检出率为89.47%,与药敏试验的结果相比,符合率为89.47%;在56株耐SD的大肠杆菌中有53株检出耐药基因,与药敏试验的符合率为94.64%。二重PCR方法与常规PCR的结果符合率为98.5%,具有很高的一致性;与药敏试验也有很好的符合率,具有较高的特异性。整个试验过程只需7 h,比常规PCR节约7 h,检测速度有了较大的提高。

载脂蛋白E基因多态性在中国4个民族中的分布

本研究提取中国东北汉族和达斡尔、鄂伦春、鄂温克等 4个人群的基因组 DNA后 ,利用PCR- RFLP方法扩增 apo E基因第 4外显子片段并进行遗传分析 ,计算各个人群中的 apo E等位基因频率。结果发现 4个人群中的 apo E等位基因频率分布趋势与国内外报告基本一致 ,但等位基因ε3

多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157

目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合。其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16SrRNA。该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA2 9,设计了 1对引物和 3条探针 ,建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针 ,边扩增边检测 ,步骤简单 ,不需PCR后处理 ,可避免假阳性和交叉污染 ;诱捕PCR ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测 ,减少了核酸不纯出现的漏检 ,由于增加了核酸杂交探针 ,可不需凝胶电泳EB染色检测 ,不会出现假阳性问题。

人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定

目的:体外分离足月妊娠胎盘滋养层细胞,观察其形态学特点,检测人类白细胞抗原-E(HLA-E)在滋养层细胞的表达情况。方法:采用0.25%胰酶和胶原酶I联合消化法及Percoll密度梯度分离法分离人足月妊娠胎盘组织中滋养层细胞,光学显微镜观察分离出的细胞形态,透射电镜观察分离出的细胞超微结构;RT-PCR技术检测分离出的滋养层细胞HLA-E的表达。结果:光学显微镜下初分离的细胞呈大圆形,以单个核为主;透射电镜下可见细胞表面的微绒毛丰富,胞质丰富,内质网扩张明显,有丰富的糖原颗粒、髓样小体和明显的脂滴。在分离的细胞上检测到HLA-E的表达。结论:采用胰酶和胶原酶I联合消化及Percoll密度梯度分离法可获得高纯度的滋养细胞,在透射电镜下可见到超微结构,同时检测到滋养层细胞上表达HLA-E。

人白细胞介素-3基因翻译起始区的改造提高其在大肠杆菌中的表达水平

为了提高人白细胞介素-3(hIL-3)在大肠杆菌中的表达,在计算机辅助下,设计合成了PCR突变引物,用于改造起始密码AUG上下游序列,并在不改变5＇端氨基酸编码的前提下,尽可能选用大肠杆菌高频使用的密码子。将经改造后的hIL-3cDNA和翻译起始区置于P_L启动子之下,转入大肠杆菌Tap106,经42℃热诱导后,获得表达产物,提高表达水平近一倍,表达量达到菌体总蛋白量的30％左右。表达产物经Western blot验证,经PVDF膜转移后进行N端顺序分析,证明前15个氨基酸正确,产物经包涵体纯化后,纯度提高至80％以上,初步复性后能明显促进hIL-3依赖细胞的生长。

载脂蛋白E基因型分型方法研究

目的：为调查海南省老年性痴呆患者载脂蛋白Ｅ（Ａｐｏ Ｅ）基因频率，建立一种简便、快速、准确的人载脂蛋白Ｅ基因型检测方法。方法：应用碘化钠法提取模板ＤＮＡ，聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增Ａｐｏ Ｅ基因含１１２ 位和１５８ 位氨基酸的基因序列，扩增产物用限制内切酶Ｈｈａ Ｉ酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，观察酶切位点的限制性片段长度多态性（ＲＦＩＰ）图谱。结果：碘化钠法提取模板ＤＮＡ 与经典法无差异；运用ＰＣＲ－ ＲＦＩＰ法检测３０ 名健康人Ａｐｏ Ｅ基因型，实验成功。结论：该方法简单、快速、准确，适合于一般实验室开展Ａｐｏ

实验感染的猕猴血清和粪便中HEVRNA动态变化研究

应用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法检测实验感染ＨＥＶ猕猴急性期血清及粪便标本中ＨＥＶＲＮＡ，并与其血清ＡＬＴ异常和抗－ＨＥＶＩｇＧ阳转相比较，以了解猕猴感染ＨＥＶ后上述各项标志的动态变化规律。结果表明，ＨＥＶＲＮＡ血症多出现于ＡＬＴ升高之前，持续约１～２周，当血清抗－ＨＥＶｌｇＧ阳转时ＨＥＶＲＮＡ即转为阴性；粪便ＨＥＶＲＮＡ可与病毒血症同时出现，但持续时间较病毒血症为长，于感染后３～４周仍可检测到。

Alzheimer病和血管性痴呆患者载脂蛋白E基因多态性分析

探讨ApoE多态性与Alzheimer病（AD）和血管性痴呆（VD）的关系。方法：应用PCR—RFLP技术分析25例AD，30例VD及40例对照组人群的ApoE基因型。结果：与对照组相比较，AD和VD患者ε3频率降低（P＜0．05），ε4频率升高（P＜0．05），两组患者间各等位基因频率差异无统计学意义（P＜0．05）。结论：ApoE多态性与AD和VD的发病机制相关，其在这两种疾病中的作用相似。

大肠杆菌MG1655菌株ERIC-PCR图谱主带序列组成分析

ERIC PCR已经在细菌分类、鉴定及混合菌群分析中得到广泛应用 ,但对其产物形成规律的认识仍存在分歧。以大肠杆菌MG1 655为对象 ,对其ERIC PCR指纹图谱中 1 1kb主带中的DNA片段进行了克隆、测序、基因组定位以及引物匹配分析。结果表明 ,这条1 1kb主带由分布在基因组中不同位置的 3种序列不同的片段组成 ,各片段的丰度差异较大 ,最高为 97 89% ;3种片段中的 2种所在的基因组区域仅一端含有ERIC序列。推测对含有ERIC序列的基因组DNA进行扩增时 ,ERIC PCR是一种非随机扩增。

猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法的研究

以猪附红细胞体和多种血营养菌16S rRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r,在反向引物的5′端用生物素标记,以猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的可变区序列设计种特异性寡核苷酸探针,探针的5′端用地高辛标记,成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。通过测定不同浓度PCR产物对应的微孔板杂交-酶反应显色OD值,用SPSS统计软件进行回归分析,得到回归方程为y=2.1012-0.4492×logx,其相关系数R为0.977,显示对未知样品可进行定量检测。该方法与猪的多种细菌性病原、猫血巴尔通氏体CA株和E.wenyonii无交叉反应,其敏感性比常规PCR琼脂糖电泳检测提高了近100倍。用建立的方法对38份临床样品进行检测,结果有12份检测结果为阳性。

大肠杆菌O157特异基因的PCR检测方法

目的:建立一种灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157的PCR方法。方法:针对大肠杆菌O157特异性基因rfbO157设计引物,扩增一497 bp的O157标识序列。结果:应用该PCR反应体系,对4株O157菌株和14株非O157菌株扩增结果表明,O157菌株均扩增出预期的497 bp片段,14株非O157菌株则为阴性。纯菌液检测灵敏度为60 cfu/PCR反应,模拟混合菌液检测灵敏度为400 cfu/PCR反应。结论:该方法用于肠出血性大肠杆菌O157的检测鉴定简便、快捷,具有很高的特异性和灵敏度,为O157的临床辅助诊断提供了有力手段。

NY-ESO-1基因在人食管癌中的表达及其基因克隆

背景与目的:NY-ESO-1是从食管癌cDNA文库中筛选到的肿瘤抗原,但是该基因在食管癌组织中的表达情况尚未见报道。本文研究NY-ESO-1基因在食管癌中的表达率,以便于确定食管癌患者是否可以使用以NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法:采用RT-PCR方法检测了NY-ESO-1基因在30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达;采用分子克隆的方法从食管癌组织中克隆了NY-ESO-1cDNA。结果:NY-ESO-1基因在食管癌组织中的表达率为50%(15/30),在30例相应癌旁正常组织中未见表达;克隆的NY-ESO-1cDNA序列与GenBank报道一致。结论:NY-ESO-1基因在食管癌中高频率表达,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-I类分子限制性CTL识别。