重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定

目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。

重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌

目的近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注。文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础。方法用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆。结果酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌。结论成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础。

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGK INVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础。方法将invA基因克隆于pGK b le24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGK INVA。质粒pGK INVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株。结果从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGK b le24构建重组穿梭质粒pGK INVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在K orthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株。结论成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGK INVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析。

戊型肝炎病毒开放读框2的克隆及表达载体的构建

戊型肝炎病毒 (HEV)为单股正链RNA病毒 ,整个基因组有 3个开放性阅读框架 (ORF) ,ORF2 (全长约 1.98kb)是主要结构基因编码区。将经过PCR获得的ORF2基因插入非分泌型酵母穿梭质粒pPIC3,构成受醇氧化酶(AOX2 )的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒 ,重组质粒经酶切线性化后转化入酵母细胞GS115 ,经过鉴定可挑取与酵母染色体发生交换的重组体 。

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法

利用大肠杆菌-酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pGBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0.5-2.0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。

人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达

目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。

分枝杆菌噬菌体D29裂解酶基因的表达与鉴定

目的:在耻垢分枝杆菌中表达预测的噬菌体D29裂解酶基因片段,鉴定其细胞壁裂解活性。方法:在分析分枝杆菌噬菌体D29开放阅读框序列的基础上,用PCR法从噬菌体D29基因组DNA中扩增出与裂解酶同源性较高的序列gene10,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒后,在耻垢分枝杆菌中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE检测,对诱导培养重组菌进行混浊度测定、透射电镜观察以鉴定其裂解活性。结果及结论:成功构建了重组穿梭质粒pUV-gene10并使gene10在耻垢分枝杆菌中获得表达,表达产物能有效降低宿主菌培养液混浊度,降解宿主菌细胞壁,证实gene10表达产物为噬菌体裂解酶,并推测其为非经典分泌蛋白。