硫氧还蛋白促进人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中高效可溶表达

为实现人胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在大肠杆菌中的高效可溶表达,获得大量具生物活性的IGF-1。应用融合PCR技术构建trx-igf1融合基因,克隆至p ET30a载体。重组载体pET30a-Trx-IGF-1转化大肠杆菌C43(DE3),并进行条件优化大量表达可溶性蛋白Trx-IGF-1。利用His标签纯化表达产物,对纯化蛋白进行Western blot与生物活性分析。构建的pET30a-Trx-IGF-1重组载体转化大肠杆菌C43(DE3)后,在30℃培养条件下1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,获得大量以可溶形式表达的融合蛋白Trx-IGF-1;采用Ni离子亲和层析,获得纯度达90%以上的融合蛋白,经Western blot检测具有IGF-1抗原活性。生物学活性检测显示,融合蛋白Trx-IGF-1能明显促进NIH3T3细胞增殖及细胞周期进展。本研究应用的载体蛋白Trx,能实现在大肠杆菌中高效可溶表达具生物活性的IGF-1,为包涵体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。

Stx2B与IntiminC300融合蛋白的构建、表达及免疫保护研究

目的 构建表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 57∶H7志贺毒素Ⅱ结合亚单位 (Stx2B)与紧密黏附素C 端免疫保护性片段 (IntiminC30 0 )的融合蛋白 (Stx2B IntiminC30 0 ) ,并观察其免疫保护作用。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增Stx2B的编码基因stx2b ,T A克隆后在前期已构建原核表达质粒 pET 2 8a( + ) eaeC30 0的基础上构建融合基因表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测 ;通过包涵体洗涤与阴离子柱层析纯化 ,获得目的蛋白Stx2B IntiminC30 0 ,以Al(OH ) 3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠 ,再以EHECO1 57∶H7超声破菌液腹腔注射免疫后的小鼠 ,观察攻毒保护效果。结果 PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增出了约 2 90bp的目的片段 ;原核表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5% ;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 4 3× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。纯化后目的蛋白Stx2B IntiminC30 0的纯度达 75% ,免疫BALB/c小鼠后血清特异性抗体阳转率及抗体效价均显著增高 ,能够抵御致死剂量EHECO1 57∶H7超声破菌?

特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

【目的】通过探究特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白(HiC-OMP25)在不同大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中的表达情况、底物降解情况、热稳定性及宿主菌细胞膜通透性与细胞表面疏水性,揭示表达HiC-OMP25时不同宿主菌的差异性,并进一步提高HiC-OMP25在大肠杆菌中的表达量。【方法】分别在E.coli BL21(DE3)及E.coli C43(DE3)中表达HiC-OMP25,并测定其对对硝基苯丁酸酯(4-nitrophenol butyrate,p NPB)、聚丙烯酸乙酯(polyethyl acrylate,PEA)的降解效果、50℃稳定性;测定表达HiC-OMP25时宿主菌的细胞膜通透性及细胞表面疏水性变化;共表达伴侣蛋白提高HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量。【结果】HiC-OMP25在E.coli BL21(DE3)与E.coli C43(DE3)中均成功表达并降解pNPB,但前者对PEA的降解效果及50℃稳定性均低于后者。同时,表达HiC-OMP25显著增强了E.coli BL21(DE3)的细胞膜通透性及细胞表面疏水性。HiC-OMP25与巯基氧化酶(Erv1p)、二硫键异构酶(DsbC)在E.coli C43(DE3)中共表达时,其表达量为原始菌株的2.14倍,且对pNPB及PEA均有良好的降解效果。【结论】异源表达时,HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中正确折叠,而在E.coli BL21(DE3)中未完全正确折叠;通过共表达伴侣蛋白提高了HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量,为以后HiC-OMP25的工业化生产及应用奠定了基础。